现代生物技术综合实验.ppt

《现代生物技术综合实验.ppt》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在行业资料-天天文库。

1、实验要求两人一组，独立实验每次实验完成均要求写实验报告及思考题不得旷课，特殊情况可补实验每次实验安排2人配制琼脂糖凝胶本课程考核前6个实验共计50分（实验报告和思考题）（本部分成绩也是《基因工程》的平时成绩）综合实验（包括设计报告）共计50分实验一质粒DNA的制备与质量鉴定一、实验目的学习并掌握基因工程操作技术中最常用的载体质粒DNA的提取方法。二、实验原理在碱性溶液中，双链DNA氢键断裂，DNA双螺旋结构遭破坏而发生变性，但由于质粒DNA分子量相对较小，且呈环状超螺旋结构，即使在高碱性pH条件下，两条互补链也不会完全分离，当加入中和缓冲液时，变性质

2、粒DNA又恢复到原来的构型；而线性的大分子量细菌染色体DNA则不能复性，与细胞碎片、蛋白质、SDS等形成不溶性复合物，通过离心沉淀，细胞碎片、染色体DNA及大部分蛋白质等可被除去，而质粒DNA及小分子量的RNA则留在上清液中，再用酚/氯仿处理，可去除残留蛋白质，混杂的RNA可用RNA酶(RNAase)消除。三、实验材料与主要试剂实验材料：含pEGFP质粒的大肠杆菌DH5α主要试剂：溶液I：50mM葡萄糖，10mMEDTA，25mMTris-HCl（pH8.0），用前加溶菌酶4mg/L溶液II：0.2mol/LNaOH溶液（内含1%SDS）,现配现用溶

3、液III（pH4.8）:60mL5mol/L醋酸钾，11.5mL冰醋酸，28.5mLH2O；饱和酚/氯仿/异戊醇（25:24:1）、酚/氯仿（1:1，V/V）TE缓冲液（pH8.0）:10mMTris-HCl，1mMEDTA，含RNA酶（RNaseA）:20µg/ml醋酸钠（pH5.2）、70%乙醇、无水乙醇四、实验步骤1)吸取1.4ml菌液至1.5ml离心管中。2)离心(8000r/min，1min)，弃上清液（根据菌液浓度判断是否需要重复1~2次）。3)加入150µL溶液Ⅰ，用旋涡振荡器充分悬浮菌体。4)加入200µL溶液Ⅱ，加盖后温和颠倒5~6

4、次，直至呈透明状。此步骤在5分钟内完成。5)加入150µL预冷的溶液Ⅲ，加盖后反复颠倒混匀，直至出现白色絮状沉淀，冰浴5min。6)离心(14000r/min，5min)，移取上清液于另一干净离心管。7)向上清液中加等体积的苯酚/氯仿/异戊醇（25:24:1），振荡混匀抽提，离心(14000r/min，5min)，溶液将出现分层。8)移取上层水相溶液（约450~500µL）于另一干净离心管，加等体积氯仿，振荡混匀抽提，离心(14000r/min，5min)，溶液将出现分层。9)移取上层水相溶液于另一干净离心管，加入1/10体积的醋酸钠（pH5.2）和

5、2倍体积无水乙醇混匀，冰浴30min。10)离心(14000r/min，10min，4℃)，倒掉上清液。11)加0.5ml预冷的70%酒精振荡，洗DNA沉淀一次，离心5min，倒掉上清液。12)真空抽干或室温自然干燥.13)加20~30µLTE缓冲液使DNA完全溶解，室温放置10min，降解RNA杂质，少量用于琼脂糖凝胶质量检测，剩余质粒-20℃保存备用。14)1%琼脂糖凝胶配制：称取1g琼脂糖粉末，加入100ml0.5倍TBE溶液，加热熔化，稍降温后，加入5µL溴化乙锭（EB），混匀，制备凝胶板，冷却后备用。15)每位同学各取5µL质粒DNA加入1

6、µL6×loadingbuffer，混匀，进行点样。16)电泳条件：120v，40min；电泳完成后，胶块通过凝胶成像系统检测，观察实验结果，并拍照记录。五、实验结果观察并分析电泳图片六、实验报告按实验内容完成实验报告及教材上的思考题。实验二质粒DNA的片断化及分离一、实验目的1、学习利用紫外分光光度法鉴定DNA质量2、采用Ⅱ型限制性核酸内切酶切割质粒DNA，并通过琼脂糖凝胶电泳分析酶切效果。二、实验原理DNA吸收光谱峰在260nm处，测定此波长下DNA溶液的OD值，当OD260=1时，双链DNA含量约为50µg/mL，据此可用紫外分光光度计测定溶液

7、中DNA含量。由于蛋白质吸收峰在280nm处，在测定DNA含量时，通过计算OD260/OD280值，可了解所测DNA的纯度，如该值为1.8～2.0时，DNA纯度高。已知Ⅱ型限制性核酸内切酶能专一识别碱基序列，并在该处切断双链DNA，形成一定长度和序列的DNA片段。酶切反应需Mg2+等金属离子以及一定浓度的盐离子，不同内切酶对盐离子有不同的要求，如盐离子浓度使用不当或甘油含量过高（﹥5%），会使酶的识别位点发生改变，产生星活性。绝大多数酶的反应温度37℃。三、实验材料：实验一提取的质粒DNA四、试剂限制性核酸内切酶XbaI；缓冲液10×MBuffer；

8、0.1%BSA;0.5×TBEBuffer；1%琼脂糖五、实验步骤1、DNA的测定空白测定(Blank)：吸