现代生物技术实验.doc

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1、实验一实验仪器的介绍（4课时）介绍本院已有的实验仪器和设备，使学生了解仪器设备的基木原理和操作方法。实验二质粒的提取和纯化（8课时）实验目的：了解碱裂解法制备质粒的原理，掌握质粒的小量制备方法。实验原理：质粒DNA的抽提是基因工程操作屮最常用与最基本的技术，现已有多种成熟的方案可供选择。最常用的有利用碱性条件下质粒DNA与染色体D7A变复性的不同进行分离的碱法；利用酸性、低离子强度吋超螺旋在水相屮，开环、线型分子在酚相屮进行分离的酸酚法；利用拜基磷灰石在特定的条件下（8mol/L尿素，0.24mol/L磷酸缓冲液pH=6.8）

2、只吸附双链DNA的疑基磷灰石法（在丄述条件下染色体DNA均成单链，质粒DNA保持双链）等。本实验选做的是碱法。1.裂解细胞裂解细胞是指通过溶菌酶、去污剂等试剂破裂细胞壁与膜的过程。对于不同的菌要选用不同的方法，通常有煮沸法、非离子型去污剂法、碱性SDS法（简称碱法）等。三种方法比较而言，非离子型去污剂法较温和，适用于抽提10kb左右的质粒；而煮沸法与碱性SDS法相对较剧烈，只能抽提小于10kb的质粒。常用的离子型去污剂是SDS、菲离子型去污剂有TritonX-100等。2.分离即将质粒DNA和染色体DNA分离。碱法的分离原理如

3、下：大肠杆菌的染色体约有4700kb长，在处理细胞过程屮都断裂成不同长度的双链DNA片段。半溶液的pH调到大于12吋双链DNA屮的氢键被破坏，于是染色体DNA的双链分离成单链；而超螺旋状态的质粒DNA仅仅是氢键被破坏，并只发生部分双链解离成单链的变化。再半pH调冋屮性吋单链DNA互相缠绕且与蛋白质结合生成网络状大分子，而超螺旋的质粒发生复性反应后仍是小分子，通过离心的方法很容易将二者分开，达到分离的FI的。3.纯化细胞裂解液屮的杂质除了染色体DNA外还有各种细胞壁、膜碎片、蛋白质、脂质类物质及RNA。纯化的步骤就是有针对性地将

4、它们去除。RNA可用牛朕RnaseA分解除去。蛋白质可通过酚、酚/氯仿、氯仿/异戊醇，使蛋白质变性剂而除去，同吋，氯仿有强烈的溶脂倾向，对于在除去蛋白质的同吋去除脂质类杂质很有好处。氯仿还能将微量的、溶于DNA水溶液的酚抽提掉，而微量的酚对于以后的酶切、转化等过程都会产生不利影响。氯仿/并戊醇的蛋白质变性能力较弱，主要用于含酚试剂处理后的抽提。正确的去除蛋口质杂质的过程：应该是酚f酚+氯仿[(l:l)]f氯仿(或氯仿/界戊醇24:1)处理，根据实验情况也可考虑省略第一或第二步，但切记不可将氯仿(氯仿/异戊醇)的处理步骤省略掉。

5、抽提过程完成后的水溶液屮仍有痕量的酚、氯仿等，可用乙醇沉淀的方法将它们除去。用无水乙醇沉淀的特点是能将DNA进行浓缩，II同时也更换了整个缓冲系统，但DNA也有一定的损失。实验内容：试剂1・13培养液(让)细菌培养用蛋白月东10g细菌培养用酵母粉5gNaCl10g用lOmol/LNaOH调至pH7.0,高压蒸气灭菌，4°C贮存。2.溶液I,可成批配置，灭菌后4°C贮存。葡萄糖50mmol/LTris-Cl(pH8.0)25mmol/LEDTAlOmmol/L3.溶液II(新鲜配制)NaOH0.2mol/LSDS1%4.溶液II

6、I5mol/LKAc60ml冰醋酸11.5ml水28.5ml配制好的溶液III含3mol/L钾盐，5mol/L醋酸(pH4・8)。卡那霉素(Kana):50mg/ml,过滤除菌。5.重蒸酚：市售苯酚蒸馆纯化(收集179〜181°C之间的酚)后，用TE饱和，使水相的pH在7.5以丄，4°C保存。6.氯仿:并戊醇(24:1)2.无水乙醇3.RNaseA(10mg/ml)4.3mol/LNaAc(pH5.2)5.TE：lOmmol/LTris-Cl(pH8.0)lmmol/LEDTA材料含有质粒(pNTE-EGFP,pEGFPN3)

7、的大肠杆菌DH5ao操作步骤1.挑取琼脂培养板上的含有pNTE-EGFP,pEGFPN3质粒的单菌落，接种至5mlLB培养液(含Kami50ug/ml),37°C振荡培养过夜。2.取岀1.5ml培养液至l・5ml离心管中,12000r/min离心2min,弃上清。3.将细菌沉淀重悬于100n1预冷的溶液工中，强烈振荡混匀。4.加入200ul溶液II,盖严管盖，轻轻颠倒混匀5次，冰浴5mino5.加入150u1预冷的溶液III,温和振荡10s,冰浴5mino6.12000r/min室温离心5min,取JL清至一个新的无菌的1.5

8、mlEppendorf管屮。7.加入等体积酚/氯仿(1:1),振荡混匀，12000r/min离心2min,上清转移至另一个Eppendorf管中。【注意】酚具有腐蚀性，操作时小心。8.加入等体积氯仿，振荡混匀，12000r/min离心2min,上清转移至另一个Eppendor