水和饮料中细菌总数和总大肠菌群的测定.doc

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1、水和饮料中细菌总数和总大肠菌群的测定1、实验目的1.1学习水样的采取方法、了解和学习水中细菌总数和大肠菌群的测定原理和测定意义。1.2学习和掌握用稀释平板计数法测定水中细菌总数的方法。1.3学习和掌握水中大肠菌群的检测方法。2、实验原理2.1水中细菌总数可说明被有机物污染的程度，细菌数越多，有机物质含量越大。所谓细菌总数是指1mL或1g检样在牛肉膏蛋白胨琼脂培养基中，37℃经24h培养后，所生长的菌落数。本实验所用的方法是稀释平板计数法，由于计算的是平板上形成的菌(colony-formingunit，cfu)数，故其单位应是cfu/g(mL)。它反映的是检样中活菌的数量。2.

2、2所谓大肠菌群，是指在37℃、24h内能发酵乳糖产酸、产气的兼性厌氧的革兰氏阴性无芽胞杆菌的总称，主要由肠杆菌科中四个属内的细菌组成，即埃希氏杆菌属、柠檬酸杆菌属、克雷伯氏菌属和肠杆菌属。水的大肠菌群数是指100mL水检样内含有的大肠菌群实际数值，以大肠菌群最近似数(MPN)表示。2.3水中大肠菌群的检验方法，常用多管发酵法和滤膜法。多管发酵法可运用于各种水样的检验，但操作繁琐，需要时间长。滤膜法仅适用于自来水和深井水，操作简单、快速，但不适用于杂质较多、易于阻塞滤孔的水样。多管发酵法包括：初发酵试验、平板分离和复发酵试验。2.3.1初发酵试验发酵管内装有乳糖蛋白胨液体培养基，

3、并倒置一德汉式小套管。乳糖能起选择作用，因为很多细菌不能发酵乳糖，而大肠菌群能发酵乳糖产酸产气。培养基内加溴甲酚紫作为pH指示剂，细菌产酸后，培养基由紫变黄。发酵管经37℃培养24h，小套管中有气体形成，并且培养基浑浊，颜色改变，说明说中存在大肠菌群，为阳性结果。但是，有个别其他类型的细菌此条件下可能产气，且产酸不产气的发酵管，也不一定非大肠菌群，因其也可能延迟48小时才产气，这两种情况应视为可疑结果，因此需继续进行下面实验，才能确定是否为大肠菌群。48小时后仍不产气的为阴性结果。2.3.2平板分离伊红美蓝琼脂平板含有伊红和美蓝染料，在此亦作为指示剂，大肠菌群发酵乳糖造成酸性环

4、境时，该两种染料即结合成复合物，使大肠菌群产生带核心的、有金属光泽的深紫色菌落。初发酵管24h内产酸产气和48小时产酸产气的均需在以上平板上划线分离，培养后，将符合大肠菌群菌落特征的菌落进行革兰氏染色，只有染色为革兰氏阴性、无芽孢杆菌的菌落，才是大肠菌群菌落。2.3.3复发酵试验将以上证实为大肠菌群阳性的菌落，接种复发酵，其原理与初发酵相同，经24h培养产酸又产气的，最后确定为大肠菌群阳性结果。根据确定有大肠菌群存在的初发酵管数目，查阅专用统计表，得出总大肠菌群指数。1、实验器材3.1培养基3.1.1普通乳糖蛋白胨培养液蛋白胨10g，牛肉膏3g，乳糖5g，氯化钠5g，1.6％溴

5、甲酚紫乙醇液1.0mL，蒸馏水1000mL，pH7.2~7.4。将蛋白胨、牛肉膏、乳糖、氯化钠加热溶解于1000mL蒸馏水中，调节pH为7.2~7.4，再加入1.6％溴甲酚紫乙醇液1.0mL，充分混匀，分装于有德汉氏小管的试管中，每管10mL，115℃灭菌20min。3.1.2三倍浓缩乳糖蛋白胨培养液按上述普通乳糖蛋白胨培养液浓缩三倍配制，分装于有德汉氏小管的试管中，每管5mL。3.1.3伊红美蓝培养基（EMB培养基）（供发酵法平板分离用）蛋白胨10g，乳糖10g，K2HPO42.0g，琼脂20g，蒸馏水1000mL，2％伊红（曙红）水溶液20mL，5％美蓝（亚甲蓝）水溶液13

6、mL，pH7.2~7.4。3.2溶液和试剂自来水、奶茶、池塘水、革兰氏染色液、无菌水等3.3仪器和其他用品显微镜、载玻片、灭菌三角瓶、灭菌带塞空瓶、灭菌移液管、灭菌试管、德汉氏小管、、灭菌培养皿。1、操作步骤4.1水样的采集：4.1.1自来水：先将自来水龙头用火焰灼烧3分钟灭菌，再开放水龙头使水流五分钟后，在火焰旁打开灭菌三角烧瓶瓶塞，接取水样以备分析。4.1.2池塘水：在距岸边5m处，取距水面10-15cm的深层水样，先将灭菌的具塞三角瓶，瓶口向下浸入水中，然后翻转过来，除去玻璃塞，水即流入瓶中，盛满后，将瓶塞盖好，再从水中取出。4.1.3奶茶：在无菌操作下，将已封闭的饮料打

7、开，在火焰旁用三角瓶取样，并迅速进行分析4.2水样中细菌总数的检测4.2.1自来水中细菌总量的检测4.2.1.1用灭菌吸管吸取1ml水样，注入灭菌培养皿中。共做两个平皿。4.2.1.2分别倾注约15ml已溶化并冷却到45度左右的牛肉膏蛋白胨琼脂培养基，并立即放在平整的桌面上，做平面旋转摇动，使水样与培养基充分混匀。4.2.1.3另取一灭菌培养皿，不加水样，倾注牛肉膏蛋白胨琼脂培养基15ml，做空白对照。4.2.1.4培养基凝固后，倒置于37度，培养24小时，进行菌落计数。两个平板的平均菌落数