水中细菌总数的测定和大肠菌群的检测

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1、水中细菌总数的测定和大肠菌群的检测（1）录入时间:2010-9-2511:17:29来源：生物信息网（一)实验目的   (1)了解和学习水中细菌总数和大肠菌群的测定原理和测定意义。   (2)学习和掌握用稀释平板计数法测定水中细菌总数的方法。   (3)学习和掌握水中大肠菌群的检测方法。（二)实验原理   水是微生物广泛分布的天然环境。各种天然水中常含有一定数量的微生物。水中微生物的主要来源有：水中的水生性微生物(如光合藻类)、来自土壤径流、降雨的外来菌群和来自下水道的污染物和人畜的排泄物等。水中的病原菌主要来源于人和动物的传染性排

2、泄物。   水的微生物学的检验，特别是肠道细菌的检验，在保证饮水安全和控制传染病上有着重要意义，同时也是评价水质状况的重要指标。国家饮用水标准规定，饮用水中大肠菌群数每升中不超过3个，细菌总数每mL不超过100个。   所谓细菌总数是指1mL或1g检样中所含细菌菌落的总数，所用的方法是稀释平板计数法，由于计算的是平板上形成的菌落(colony-formingunit，cfu)数，故其单位应是cfu/g(mL)。它反映的是检样中活菌的数量。   所谓大肠菌群，是指在37℃24h内能发酵乳糖产酸、产气的兼性厌氧的革兰氏阴性无芽胞杆菌的总

3、称，主要由肠杆菌科中四个属内的细菌组成，即埃希氏杆菌属、柠檬酸杆菌属、克雷伯氏菌属和肠杆菌属。   水的大肠菌群数是指100mL水检样内含有的大肠菌群实际数值，以大肠菌群最近似数(MPN)表示。在正常情况下，肠道中主要有大肠菌群、粪链球菌和厌氧芽胞杆菌等多种细菌。这些细菌都可随人畜排泄物进入水源，由于大肠菌群在肠道内数量最多，所以，水源中大肠菌群的数量，是直接反映水源被人畜排泄物污染的一项重要指标。目前，国际上已公认大肠菌群的存在是粪便污染的指标。因而对饮用水必须进行大肠菌群的检查。   水中大肠菌群的检验方法，常用多管发酵法和滤膜

4、法。多管发酵法可运用于各种水样的检验，但操作繁琐，需要时间长。滤膜法仅适用于自来水和深井水，操作简单、快速，但不适用于杂质较多、易于阻塞滤孔的水样。(三)实验器材(1)菌落总数的测定：1)培养基：牛肉膏蛋白胨琼脂培养基，无菌生理盐水。2)器材：灭菌三角瓶，灭菌的具塞三角瓶，灭菌平皿，灭菌吸管，灭菌试管等。(2)大肠菌群的测定；   1)培养基：   ①乳糖胆盐蛋白胨培养基：   蛋白胨20g，猪胆盐(或牛、羊胆盐)5g，乳糖10g，0.04%溴甲酚紫水溶液25mL，水1000mL，pH7.4。   制法：将蛋白胨、胆盐从乳糖溶于水中

5、，校正pH，加入指示剂，分装，每瓶50mL或每管5mL，，并倒置放入一个杜氏小管，l15℃灭菌15min。   双倍或三倍乳糖胆盐蛋白胨培养基：除水以外，其余成分加倍或取三倍用量。   ②伊红美蓝琼脂培养基：   蛋白胨10g，乳糖10g，K2HP042g，2％伊红水溶液20Ml，0.65％美蓝水溶液lOmL，琼脂17g，水1000mL，pH7.1。   制法：将蛋白胨、磷酸盐和琼脂溶于水中，校正pH后分装．121℃灭菌15min备用。临用时加入乳糖并熔化琼脂，冷至50-55℃，加入伊红和美蓝溶液，摇匀，倾注平板。   ③乳糖发酵管

6、：   除不加胆盐外．其余同乳糖胆盐蛋白胨培养基。   2)器材：灭菌三角瓶，灭菌的具塞三角瓶，灭菌平皿，灭菌吸管，灭菌试管等。四）实验方法 (1)水样的采集：   1)自来水：先将自来水龙头用酒精灯火焰灼烧灭菌，再开放水龙头使水流5min，以灭菌三角瓶接取水样以备分析。   2)池水、河水、湖水等地面水源水：在距岸边5m处，取距水面10-15cm的深层水样，先将灭菌的具塞三角瓶，瓶口向下浸入水中，然后翻转过来，除去玻璃塞，水即流入瓶中，盛满后，将瓶塞盖好，再从水中取出。如果不能在2h内检测的，需放入冰箱中保存。   (2)细菌总数

7、的测定：   1)水样稀释及培养：   ①按无菌操作法，将水样作10倍系列稀释：   ⑦根据对水样污染情况的估计，选择2-3个适宜稀释度(饮用水如自来水、深井水等，一般选择1、1:10两种浓度；水源水如河水等，比较清洁的可选择1:10、1:100、1:1000三种稀释度；污染水—被选择1:100、1:1000、1:10000三种稀释度)，吸取1mL稀释液于灭菌平皿内，每个稀释度作3个重复。   ③将熔化后保温度45℃的牛肉膏蛋白胨琼脂培养基倒平皿，每皿约15mL，并趁热转动平皿混合均匀。   ④待琼脂凝固后，将平皿倒置于37℃培养箱

8、内培养24±1h后取出，计算平皿内菌落数目，乘以稀释倍数，即得1mL水样中所含的细菌菌落总数。   2)计算方法：   作平板计数时，可用肉眼观察，必要时用放大镜检查，以防遗漏。在记下各平板的菌落数后，求出同稀释度的各平板平均菌落数。