甲胎蛋白基因在转录水平上的检测ppt课件.pptx

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1、检测甲胎蛋白基因在转录水平上的的表达情况1讨论的题目甲胎蛋白基因(alpha-fetoprotein，AFP)(GenBank登录号:NM_001134.1)的异常表达与肝癌、前列腺癌等恶性肿瘤有关，请根据基因表达的检测方法，设计实验方案从转录水平检测AFP的表达情况。实验方案包括：实验目的、实验方法及原理、技术路线、可能的结果分析及应用等。2实验目的1、掌握Northern印迹杂交和RT－PCR技术的方法2、了解实验的操作方法和步骤3、判断基因在转录水平的表达情况3甲胎蛋白(alpha-fetoprotein, AFP)甲胎蛋白是肿瘤

2、相关的胚胎特异α-球蛋白,分子量约为70 kDa，是一直以来都被认为是临床诊断胎儿出生缺陷和肝细胞癌的经典肿瘤标志物。正常情况下．这种存在于胚胎早期血清中的甲胎蛋白在出生后就迅速消失，如果重现于成人血清中．则提示有肝癌的可能。4AFP基因的DNA结构AFP基因约为20 kbp大小,由15个内含子和14个外显子组成,包含590个氨基酸,其中在N末端有19个氨基酸是信号肽序列。5实验方法1、Northern印记杂交2、核糖核酸酶保护试验3、原位杂交4、RT－PCR技术5、实时荧光定量PCR6Northern印迹杂交实验原理Northern印

3、迹杂交是指将RNA变性及电泳分离后，将其转移到固相支持物上，然后利用杂交反应来鉴定其中特定mRNA分子的含量及其大小的过程。RNA印迹技术正好与DNA相对应，故被称为Northern印迹杂交，与此原理相似的蛋白质印迹技术则被称为Westernblot。7实验技术路线1、提取mRNA2、琼脂糖凝胶电泳分离RNA3、Northern印迹转移前的凝胶预处理4、Northern印迹转移5、用标记的RNA探针与转移到固相支持物上的核酸片段进行杂交6、杂交结果的显示8结果分析1、若出现明显杂交带，则表明细胞组织内有AFP基因的表达，则会有患肝癌的风

4、险。2、若没有出现明显杂交带，则表明细胞组织内基因未表达。9应用Northern印记技术多用来检查基因组中某个特定的基因是否得到转录以及转录的相对水平。目前，Northern印记技术仍然被认为是检测基因表达水平的金标准。10RT-PCR技术实验原理逆转录PCR，是将RNA的反转录（RT）和cDNA的聚合酶链式扩增（PCR）相结合的技术。首先提取组织或细胞中的总RNA，以其中的mRNA作为模板经反转录酶或随机引物的作用从RNA合成cDNA，再以cDNA为模板，扩增合成目的片段检测基因表达。11试验技术路线1、提取mRNA2、反转录ｃDNA

5、链3、PCR扩增4、凝胶电泳5、结果显示12反转录酶的选择1．Money鼠白血病病毒（MMLV）反转录酶2．禽成髓细胞瘤病毒（AMV）反转录酶3．Thermusthermophilus、Thermusflavus等嗜热微生物的热稳定性反转录酶。4．MMLV反转录酶的RNaseH突变体13引物设计的原则1、长度及碱基分布2、引物之间及引物自身3、引物3’端4、引物5’端5、二级结构区6、简并引物14结果分析1、若有AFP基因表达，则在与其反转录cDNA链分子量平行处应有检测信号。2、若AFP基因未表达，则在与其反转录cDNA链分子量平行处

6、没有检测信号。。15应用1、分析基因的表达2、获取目的基因3、合成cDNA探针16Northern印迹杂交与PCR方法的比较Northern印迹杂交技术检测mRNA表达水平的敏感性较PCR技术低，但其特异性强，假阳性率低，因此被认为是最可靠的mRNA和miRNA定量分析方法之一。RT-PCR使RNA检测的灵敏性提高了几个数量级，使一些极为微量RNA样品分析成为可能。17谢谢观看18此课件下载可自行编辑修改，供参考！感谢您的支持，我们努力做得更好！