抗肿瘤药物评价技术

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1、抗肿瘤药物评价技术指导原则抗肿瘤药物药效学指导原则细胞毒类抗肿瘤药物非临床研究技术指导原则化学药物一般药理学研究技术指导原则中药、天然药物一般药理学研究技术指导原则抗肿瘤药物药效学研究的要求1体内、体外实验方法相结合；以体内实验为主••2体外实验选用10-15株人癌细胞株，至少重复一次体内抗肿瘤试验必须选用三种以上肿瘤模型，其中至3少一种为人癌裸小鼠移植模型或其它人癌小鼠模型。试验结果三种模型均为有效，再重复一次也为有效体外抗肿瘤活性试验体外抗肿瘤活性试验试验目的对候选化合物进行初步筛选了解候选化合物的抗瘤谱为随后进行的体内抗肿瘤试验提供参考体外抗肿瘤活性试验体外抗肿瘤活性

2、试验试验方法•选用10-15株人癌细胞株•试验还应考察受试物对耐药肿瘤细胞系和正常人源细胞的作用和影响•使用MTT还原法、磺酰罗丹明B(SRB)染色法•药物与细胞共培养时间一般为48-72小时，贴壁细胞需先贴壁24小时后再给药。•试验应设阴性、阳性、溶媒对照组，阳性对照用一定浓度的标准抗肿瘤药。•试验至少应重复一次体外抗肿瘤活性试验体外抗肿瘤活性试验四氮唑盐还原法试验原理：四氮唑[MTT,3-(4,5-dimethylibiazol-2-yl)-2,5-diphenyl--tetrazoliumbromide]是一种能接受氢原子的染料。活细胞线粒体中与NADP相关的脱氢酶在

3、细胞内可将黄色的MTT转化成不溶性的蓝紫色的甲[月替](formazan)，而死的细胞则无此功能。用二甲基亚讽(DMSO)溶解甲[月替]后，在一定波长下用酶标仪测定光密度值，即可定量测出细胞的存活率。方法要点：受试样品处理细胞结束后，加入5mg/mlMTT液20微升//孔，继续培养四小时。再加三联液并培养过夜。在酶标仪上于490nm波长处检测OD值。观测指标直接指标为96孔板上各被测孔的OD值；然后按公式（对照组OD值-治疗组OD值）/对照组OD值×100%计算出相应的细胞生长抑制率；剧情况可进一步采用Logit法计算50%生长抑制浓度IC50IC50值。体外抗肿瘤活性试验

4、体外抗肿瘤活性试验磺酰罗丹明染色法试验原理：SRB(sulforhodamineSRB(sulforhodamine是一种蛋白质结合染料，粉红色，可溶于水。SRB可与生物大分子中的碱性氨基酸结合。其在515nm波长的OD读数与细胞数呈良好的线性关系。故可用作细胞数的定量。MTT法的一个缺点是OD值可随放置时间而变，而SRB法无此现象。因此更适用于进行大规模的试验。方法要点：用10%冷三氯乙酸与4℃固定已经受试样品处理的细胞1h，洗涤，干燥；加入4mg/mlSRB液100微升/孔染色15min，1%冰醋酸洗涤，干燥；最后加入150微升/孔的Tris溶液，在酶标仪上与515nm

5、波长处检测OD值。观测指标同MTT法。另外，NCI目前采用以下指标评价化合物的体外抗肿瘤活性。测定的OD值包括对照组、加药组及加药时的细胞的OD值C、T、和T0。据此计算：生长抑制率（%）=（T－T0）/（C—T0）×100%；按生长抑制率或细胞死亡率对样品浓度绘出量效关系曲线图，并求出IC50体外抗肿瘤活性试验体外抗肿瘤活性试验染料排斥法试验原理：活细胞有排斥某些染料如伊红、台盼蓝、苯胺黑等的能力，而死细胞由于膜完整性的破坏，可被着色。因此培养的肿瘤细胞中加入这些染料，一定时间后，对着色和未着色的细胞进行计数，即可算出被杀死的细胞比例。方法要点：向一定容积的待检细胞悬液加

6、入定量的某种染液，最常用的是0.4%台盼蓝液，混匀，室温染色5-15min，将已染色的细胞悬液滴加至血细胞计数板，直接在光镜下计数活细胞数和细胞总数。观测指标：按（未染色细胞数/细胞总数）X100%计算活细胞率，对照组活细胞率应在90%以上。根据活细胞率计算受试样品的半数致死剂量（LD50）作为药物抗肿瘤活性的指标。体外抗肿瘤活性试验体外抗肿瘤活性试验阿拉马蓝法试验原理：非荧光性蓝色底物阿拉马蓝可被活细胞中的线粒体内的NADPH相关的脱氢酶类还原为强荧光性粉红色底物，采用微培养板自动读数仪在激发与发射波长分别为530nm和590nm处读取荧光强度值，与活细胞数呈良好的线性关

7、系。方法要点：细胞经受试样品处理后，加入10-20ul阿拉马蓝染液，继续培养一定时间，用微培养板自动读数仪在激发与发射波长分别为530nm和590nm处读取荧光强度值。观测指标：根据荧光强度可以计算细胞生长抑制率，适当时可进一步计算IC50值。体外抗肿瘤活性试验体外抗肿瘤活性试验集落形成法试验原理：克隆原细胞具有持续增殖能力，当单个细胞分裂6代或6代以上时，其后代所组成的群体(集落)便含50个以上细胞。通过集落计数可对克隆原细胞作定量分析。它反映了单个细胞的增殖潜力，故能较灵敏地测定抗癌药的活性，日前被认为是一种较