DB22T 2565-2016 流感病毒分离MDCK细胞法.pdf

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1、ICS07.100C04备案号：54242-2017DB22吉本标准仅供内部使用不得翻印林省地方标准DB22/T2565—2016流感病毒分离MDCK细胞法TheisolationandculturemethodforInfluenzavirusinMDCKcell本标准仅供内部使用不得翻印2016-12-09发布2017-03-01实施吉林省质量技术监督局发布本标准仅供内部使用不得翻印本标准仅供内部使用不得翻印DB22/T2565—2016本标准仅供内部使用不得翻印前言本标准根据GB/T1.1-2009和GB/T20001.4-2015

2、给出的规则起草。本标准由吉林省卫生和计划生育委员会提出并归口。本标准起草单位：吉林省疾病预防控制中心。本标准主要起草人：李静、柳鸿敏、吴东林、臧希卉。本标准仅供内部使用不得翻印I本标准仅供内部使用不得翻印本标准仅供内部使用不得翻印DB22/T2565—2016本标准仅供内部使用不得翻印流感病毒分离MDCK细胞法警示——使用本标准的人员应有正规实验室工作的实践经验，本标准并未指出所有可能的安全问题。使用者有责任采取适当的安全和健康措施，并保证符合国家有关法规规定的条件。1范围本标准规定了无血清流感病毒分离MDCK细胞法。本标准适用于无血清流

3、感病毒分离。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB19489-2008实验室生物安全通用要求3生物安全级别和生物安全要求本标准仅供内部使用不得翻印3.1生物安全级别生物安全二级。3.2生物安全要求实验人员应穿戴医用防护服、防护鞋、医用防护口罩、工作帽、医用乳胶手套。4试剂和材料4.1无血清MDCK细胞培养液4.2流感病毒分离无血清培养液4.3青、链霉素母液：含10000U/mL青霉素G和10000µg

4、/mL硫酸链霉素4.4EDTA-胰酶：胰酶浓度为0.25%，EDTA·4Na浓度为0.53mmol/L4.5TPCK-胰酶（牛胰腺来源Ⅷ型）：2mg/mL4.6磷酸盐缓冲液（PBS）：0.01mol/L，pH值为7.24.7Hank’s液：pH值为7.2～7.44.8病毒采样液：内带拭子4.9T-25细胞培养瓶4.10无菌移液管：1mL、10mL4.11无菌离心管：1mL、10mL4.12乙醇溶液：70%～75%乙醇1DB22/T2565—20165仪器设备5.1生物安全柜：CLASSⅡ型本标准仅供内部使用不得翻印5.2倒置显微镜5.3C

5、O2恒温培养箱：35℃±1℃和37℃±1℃5.4水浴箱：37℃±1℃5.5冰箱：4℃5.6低温冰箱：-70℃5.7漩涡振荡器5.8高压灭菌器5.9台式离心机6标本6.1标本的采集6.1.1鼻拭子将带有聚丙烯纤维头的拭子轻轻插入鼻道内鼻颚处，旋转后静止待拭子头吸收分泌物以后，缓慢转动退出。将拭子头浸入病毒采样液（4.8）中，弃去拭子尾部后送检。6.1.2咽拭子本标准仅供内部使用不得翻印用带有聚丙烯纤维头的拭子擦拭双侧扁桃体及咽后壁后，将拭子浸入病毒采样液（4.8）中，弃去拭子尾部后送检。6.2标本的运送和保存新鲜采集的标本应在0℃～4℃条件

6、下48h内运送至实验室。未能48h内送至实验室的，应置低温冰箱（5.6）中保存。6.3标本处理用漩涡振荡器（5.7）将标本振荡混匀置4℃冰箱（5.5）内待其自然沉淀10min后，取900µL标本加入含有100µL青、链霉素母液（4.3）的1mL无菌离心管（4.10）中，置于4℃冰箱（5.5）内过夜。7试验步骤7.1准备试剂7.1.1无血清MDCK细胞生长液500mL无血清MDCK细胞培养液（4.1）加入5mL的青、链霉素母液（4.3）。7.1.2流感病毒生长液500mL流感病毒分离无血清培养液（4.2）加入5mL的青、链霉素母液（4.3）

7、以及0.5mLTPCK-胰酶（4.5），使TPCK-胰酶终浓度为2µg/mL。2DB22/T2565—20167.2MDCK细胞的培养7.2.1将配好的无血清MDCK细胞生长液（7.1.1）、EDTA-胰酶（4.4）和PBS（4.6）置37℃水浴预热15min，瓶体外用70%～75%乙醇擦拭后放于生物安全柜内。本标准仅供内部使用不得翻印7.2.2选择80%～90%生长融合的MDCK细胞，弃去细胞培养瓶中的培养液，用10mL无菌移液管吸取6mLPBS清洗细胞三次。7.2.3加入1mL37℃预热的EDTA-胰酶，轻轻地晃动细胞瓶，使EDTA-

8、胰酶均匀分布在整个细胞薄层。7.2.4将细胞瓶置于37℃，5%CO2恒温培养箱内孵育（约5min～10min），至细胞收缩变圆从细胞瓶内壁分离。7.2.5加5mL无血清MDCK细胞生长液（7.