DB21∕T 2537-2015 蓝舌病病毒荧光PCR检测方法.pdf

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1、ICS65.020.30B41DB21辽宁省地方标准DB21/T2537—2015蓝舌病病毒荧光PCR检测方法Methodofthereal-timeRT-PCRforthedetectionofBluetonguevirus,BTV2015-10-15发布2015-12-15实施辽宁省质量技术监督局发布DB21/T2537—2015前言本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。本标准由辽宁出入境检验检疫局提出并归口。本标准起草单位：辽宁出入境检验检疫局。本标准主要起草人：吴斌、万超、孙铭英。I

2、DB21/T2537—2015蓝舌病病毒实时荧光PCR检测方法1范围本标准规定了蓝舌病病毒（Bluetonguevirus）实时荧光PCR检测方法。本标准适用于蓝舌病病毒的检测。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法SN/T1193基因检验实验室技术要求3缩略语下列缩略语适用于本文件。Ct值：达到阈值的循环数（CycleThr

3、eshold）DEPC：焦碳酸乙二酯（Diethylpyrocarbonate）Taq酶：TaqDNA聚合酶（TaqDNApolymerase）RNA：核糖核酸（RibonucleicAcid）实时荧光PCR：荧光逆转录聚合酶链反应（RealTimeFluorescentQuantitativeReverseTranscriptionPolymeraseChainReaction）4原理采用TaqMan方法，比对蓝舌病病毒基因组S基因的核苷酸序列，设计特异性引物和特异性的荧光双标记探针进行配对。探针5'

4、端标记FAM荧光素为报告荧光基团（用R表示），3'端标记TAMRA荧光素为淬灭荧光基团（用Q表示），它在近距离内能吸收5'端荧光基因发出的荧光信号。PCR反应进入退火阶段时，引物和探针同时与目的基因片段结合，此时探针上R基团发出的荧光信号被Q基因所吸收，仪器检测不到荧光信号；而反应进行到延伸阶段时，Taq酶的5'到3'的外切核酸酶功能将探针降解。这样探针上的R基团游离出来，所发出的荧光不再为Q所吸收而被检测仪所接收。随着PCR反应的循环进行，PCR产物与荧光信号的增长呈现对应关系。5试剂和材料DB21/

5、T2537—2015除非另有说明，本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的一级水；所有试剂均用无RNA酶的容器分装。5.1试剂5.4.1DEPC水（见附录A）。5.4.20.01mol/LPBS（见附录A）5.4.3Trizol裂解液。5.4.4三氯甲烷。5.4.5乳糖蛋白胨缓冲肉汤（BLP,见附录A）5.4.675%乙醇（见附录A）。5.4.7异丙醇（-20℃预冷）。5.4.8其他试剂：荧光PCR反应缓冲液：含50mmol/LKCl（见附录A）,10mmol/LTris-HCl（pH8.3

6、）（见附录A）,2.5mmol/LMgCl2（见附录A）。可采用等效商品化试剂。5.4.9dNTPMixture(各10mM)、Taq酶(5U/μL)。引物：合成一对特异性引物：上游引物5'-GTTCTCTAGTTGGCAACCACC-3'，下游引物5'-TGCACTGCTCAGCAATCCA-3'，TaqMan探针（FAM）5'-AGTTCTCGTGGCATTTGCGTAATCC-3'（TAMRA）均配制成10umol/L，-20℃保存。5.2仪器与耗材5.4.1荧光PCR检测仪。5.4.2高速台式冷

7、冻离心机（最高可达13000r/min）。5.4.3微量移液器：0.5μL～10μL，5μL～20μL，20μL～200μL，100μL～1000μL。5.4.4混匀器。5.4.5冰箱(2℃-8℃)。5.4.6研钵。5.4.7微量可调移液器。5.4.8离心管。5.4.9吸水纸。5.4.10离心管5.4.11微量带芯吸嘴（10μL，100μL，1000μL）。6生物安全要求采样、样品处理及检测过程所涉及的实验操作，应遵守SN/T1193的有关规定。7操作步骤7.1样本的采集与处理采样过程中样本不得交叉污染

8、，采样及样品前处理过程中应戴一次性手套。7.4.1取样工具5棉拭子、剪刀、镊子、研钵、离心管（Eppendorf管）。所有取样工具应经1.01×10Pa，15min高压灭菌并烘干。7.4.2采样方法DB21/T2537—20157.1.2.1组织样品用无菌的剪刀剪取待检样品5.0g后，再加10mlBLP(配方见附录A，含青霉素2000IU/ml、链霉素2000μg/ml)加入于研钵中充分研磨，4℃浸提4h,取上清液5ml用超声波裂解处理（1