DB21∕T 2533-2015 赤羽病病毒荧光PCR检测方法

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1、ICS65.020.30B41DB21辽宁省地方标准DB21/T2533—2015赤羽病病毒荧光PCR检测方法Methodofthereal-timeRT-PCRforthedetectionofAkabanevirus2015-10-15发布2015-12-15实施辽宁省质量技术监督局发布DB21/T2533—2015前言本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。本标准由辽宁出入境检验检疫局提出并归口。本标准起草单位：辽宁出入境检验检疫局。本标准主要起草人：万超、吴斌、屈菲。IDB21/T2533—2015赤羽病病毒实时荧光PCR检测方法1范围本标准规定了

2、赤羽病病毒（Akabanevirus）实时荧光PCR检测方法。本标准适用于赤羽病病毒的检测。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法SN/T1193基因检验实验室技术要求3缩略语下列缩略语适用于本文件。Ct值：达到阈值的循环数（CycleThreshold）DEPC：焦碳酸乙二酯（Diethylpyrocarbonate）Taq酶：TaqDNA聚合酶（TaqDNApolymerase）RNA

3、：核糖核酸（RibonucleicAcid）实时荧光PCR：荧光逆转录聚合酶链反应（RealTimeFluorescentQuantitativeReverseTranscriptionPolymeraseChainReaction）4原理采用TaqMan方法，比对赤羽病病毒基因组S基因的核苷酸序列，设计特异性引物和特异性的荧光双标记探针进行配对。探针5'端标记FAM荧光素为报告荧光基团（用R表示），3'端标记TAMRA荧光素为淬灭荧光基团（用Q表示），它在近距离内能吸收5'端荧光基因发出的荧光信号。PCR反应进入退火阶段时，引物和探针同时与目的基因片段结合，此时探

4、针上R基团发出的荧光信号被Q基因所吸收，仪器检测不到荧光信号；而反应进行到延伸阶段时，Taq酶的5'到3'的外切核酸酶功能将探针降解。这样探针上的R基团游离出来，所发出的荧光不再为Q所吸收而被检测仪所接收。随着PCR反应的循环进行，PCR产物与荧光信号的增长呈现对应关系。5试剂和材料除非另有说明，本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的一级水；所有试剂均用无RNA酶的容器分装。5.1试剂1DB21/T2533—20155.1.1DEPC水（见附录A.1）。5.1.20.01mol/LPBS（见附录A.2）5.1.3Trizol裂解液。5.1.4三氯甲烷。

5、5.1.575%乙醇（见附录A.3）。5.1.6异丙醇（-20℃预冷）。5.1.7其他试剂：荧光PCR反应缓冲液：含50mmol/LKCl（见附录A.4）,10mmol/LTris-HCl（pH8.3）（见附录A.5）,2.5mmol/LMgCl2（见附录A.6）。可采用等效商品化试剂。5.1.8dNTPMixture(各10mM)、EX-Taq酶(5U/μL)。5.1.9引物：合成一对特异性引物：上游引物5'-CCCCTGGTGCTGAGATGTTT-3'，下游引物5'-CTTCCTCATGAAGTTGACATCCAT-3'，TaqMan探针（FAM）5'-ACC

6、CACTGGTTATCGACATGCACCG-3'（TAMRA）均配制成5umol/L，-20℃保存。5.2仪器与耗材5.2.1荧光PCR检测仪。5.2.2高速台式冷冻离心机（最高可达13000r/min）。5.2.3微量移液器：0.5μL～10μL，5μL～20μL，20μL～200μL，100μL～1000μL。5.2.4混匀器。5.2.5冰箱(2℃-8℃)。5.2.6研钵。5.2.7微量可调移液器。5.2.8离心管。5.2.9吸水纸。5.2.10离心管5.2.11微量带芯吸嘴（10μL，100μL，1000μL）。6生物安全要求采样、样品处理及检测过程所涉及的

7、实验操作，应遵守SN/T1193的有关规定。7操作步骤7.1样本的采集与处理7.1.1血样前处理：取2ml全血样品,3000g离心10min，弃沉淀，收集上清。继续进行核酸提取。7.1.2组织样品前处理：取100mg组织样品，剪碎，按1：5的比例加0.01mol/LpH7.6PBS研磨后冻融3次，离心，取上清液，-20℃保存，备用或直接继续进行核酸提取。7.2核酸提取所有RNA提取器皿用DEPC水浸泡24h，灭菌后方可使用。自上述完成前处理的样品中加入1mlTrizol裂解液，室温放置5min。加入0.2ml三氯甲烷，剧烈振荡15秒，室温放置3min，4℃100