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《温州地区丙型肝炎病毒感染者基因型分布特征和其临床意义研究.doc》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在工程资料-天天文库。
1、温州地区丙型肝炎病毒感染者基因型分布特征和其临床意义研究［摘要］目的探讨温州地区丙型肝炎病毒感染者基因型分布特征及其临床意义。方法收集2010年1月〜2012年12月温州市中心血站自愿献血者244例，其中，HCV感染经ELISA方法证实为HCV抗体阳性者122例,健康者122例，收集同期来温州地区某医院门诊肝病患者122例，所有对象均静脉采血，HCVRNA提取，AMV反转录，并采用巢式PCR扩增对研究对象进行HCV-RNA的检测及基因分型。结果门诊肝病患者1b总阳性率为100.0%,HCV抗体阳性者1b总阳性率为95.9%,健康者lb总阳性率为0.0%,三者比较,差异有统计学意义（x2=10
2、.28,P1资料与方法1.1一般资料收集2010年1月〜2012年12月温州市中心血站（以下简称“我站"）自愿献血者244例，经ELISA方法证实HCV抗体阳性者122例，年龄23〜56岁，其中男68例，女54例；健康者122例，年龄20〜58岁，其中男70例，女52例。收集同期温州某医院门诊患者122例，其中，输血后丙肝14例，男4例，女10例，年龄15〜64岁；散发性丙肝25例，男15例，女10例，年龄17〜60岁；肝硬化40例，男27例，女13例，年龄11〜69岁；原发性肝癌43例，男21倒，女22例，年龄23〜68岁。采集静脉血，全部血清标本均来自我站检验科及医院门诊患者。所有患者诊
3、断均符合2000年9月西安第10次全国传染病与寄生虫病和肝病学术会议修订的《病毒性肝炎防治方案》的标准：血清抗-HCV阳性、HCVRNA>80copies/mL,伴或不伴肝功能异常，均伴有不同程度的肝硬化。两组研究对象年龄、性别比例等一般资料比较，差异无统计学意义（P>0.05）,具有可比性。且研究对象均知情同意，已经我站业务科通过。1.2试剂全血RNA提取试剂盒（北京艾比根生物技术有限公司）;HCV抗体诊断试剂盒（北京科美东雅生物技术有限公司）；Taq酶、引物、RNA酶抑制剂（上海玉博生物科技有限公司）；M-MuLV逆转录酶（Simga公司）。1.3方法1.3.1PCR引物设计自Geneb
4、ank中查找HCVla、lb、2b、3a型全序列，查找各型5’UTR区共同序列，并以此自行设计引物。外引物：SI（nt34~54）：5'-ATCACTCCCCTGTGAGGAAC-3'；S2（nt279〜299）:5’-CCCTATCAGGCAGTACCACA-37；内引物：S3（nt39〜59）：5'-TCCCCTGTGAGGAACTACTG-3'；S4（nt274〜294）：5’-TCAGGCAGTACCACAAGGCC-3A。1.3.2HCVRNA提取及AMV反转录所收集的血清，12000r/min离心10min,取上清70°C冰箱保存备用。利用Trizol法提取备用血清中的病毒RNA
5、,具体操作方法为：于30uL血清中加入Trizol溶液、氯仿及异丙醇，预冷振荡并洗涤,所得RNA于-7CTC超低温冰箱中保存备用。另外在EP管中依次加入模板RNA、oligo(dT)16、dNTPmixture>RNaseInhibitor.AMV及DEPC水，混匀均匀，42°C保温1h,95°C保温5min后冰上冷却后，行反转录。1.3.3巢式PCR扩增和酶切反应于EP管中分别加入cDNA模板,TaqDNA聚合酶,10XPCRbuffer,上游引物(25mmol/L)、下游引物luL,dNTP,灭菌去离子水，行扩增，并于95°C预变性4min,95°C变性30s,55°C退火30s,7(T
6、C延伸30s,7(TC延伸5min,进行35个循环后得到第1轮扩增产物。以其为模板，等同条件下行第2轮扩增。取第2轮PCR产物，分别加入19.5uLHaeIII和Bsh1236I及buffer溶液，37°C水浴2h,2%琼脂糖凝胶电泳鉴定结果。1.4统计学方法所有数据采用SPSS15.0统计学软件进行数据分析，计数资料用率表示，组间比较采用x2检验，等级资料采用秩和检验，以P综上所述，本研究在一定程度上反映了温州地区HCV基因型分布情况，对当地丙型肝炎患者的治疗和预后判断有一定的指导意义。但由于本研究对象例数不多，还不能完全反映温州地区HCV不同基因型具体分布情况,且研究对象以慢性肝病为主，
7、缺乏无症状患者，有必要扩大样本量，选择人群资料进一步研究。[参考文献][1]万祥辉，曾照芳，杨细媚，等•丙型肝炎病毒基因分型及core蛋白区的分子演化分析[J].生物化学与生物物理进展，2008,35(8)：964-968.[2]王琰，朱新宇，王霞，等.太原地区丙型肝炎病毒基因分型及其临床意义[J].实用肝脏病杂志，2010,13(2)：109-111.[3]GarciaA,FengY,ParryNM,eta
