菲律宾蛤仔金属硫蛋白的提取方法优化.pdf

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1、第40卷第7期2010年7月中国海洋大学学报PERIODICAL()F(X'EANUNIVERSITYOFCHINA40(7)：121～125Jul．，2010菲律宾蛤仔金属硫蛋白的提取方法优化。孟范平，肖静，赵顺顺，付海防(中国海洋大学海洋环境与生态教育部重点实验室，山东青岛266100)摘要：为了利用双壳类动物金属硫蛋白(MTs)指示海洋重金属污染，有必要确定有效提取这种生物标志物的方法。本研究以暴露于含镉海水的菲律宾蛤仔内脏为试验材料，依次采用正交设计和单因素设计对内脏MT(以粗提液中的巯基含鼍表示)的提取：I=艺条件

2、进行优化。所得到的最佳匀浆条件为：Tris—HCl缓冲液浓度为0．02mol／L，pH值7．8，内脏与缓冲液的质量体积比(m／v)为1／5，其中。缓冲液的浓度对提取效果影响较大。最佳除杂条件为：匀浆液首先在4℃、20000g离心30rain，再于80℃水浴加热10rain，然后于4℃15000g离心10min。这些结果有助于重金属生物监测中蛤仔MT的经济高效提取和共存杂蛋白干扰的有效去除。关键词：菲律宾蛤仔；金属硫蛋白(MT)；提取；优化中图法分类号：0613．51文献标志码：A文章编号：1672-5174(2010)07—

3、121-05作为生物体内可被金属诱导的一类金属结合蛋白，金属硫蛋白(Metallothioneins，MTs)已被欧共体及某些国际科学组织作为水环境重金属污染评估的生物标志物[1]。用于指示环境污染的生物标志物。既要有准确可靠的分析技术，又要求它们能被充分提取，否则将直接影响其指示结果的准确性。不同地区、不同实验室的同类研究结果也难以进行相互比较。近几十年来，在MTs应用于海洋环境重金属污染早期预警的研究中，一直采用匀浆离心法提取海洋动物MTs，Tris-HCI缓冲溶液也常被作为提取剂，但是不同研究者所使用的缓冲液的浓度、p

4、H值以及动物组织与缓冲液的质量体积比各不相同，匀浆液的离心转速、时间以及离心后上清液的加热处理条件也存在较大差异[2-5]。这种状况十分不利于Mn对海水重金属污染的指示作用。菲律宾蛤仔(Ruditapesphilippinarum)，简称“蛤仔”，属于软体动物门，是我国沿海分布较为广泛的底栖双壳类动物，从潮间带到水深10m左右的水域均有栖息。蛤仔在青岛沿岸及近海的种群数量大，栖息密度高，是该地区重要的优势软体动物一]。据报道，仅胶州湾养殖的蛤仔年产量就达10×104t[7]。蛤仔在其生命活动中，处于与周围海水环境的动态平衡，

5、由于自身用于代谢的混合氧化系统存在缺陷，因而体内污染物的释放速率大大低于鱼类和甲壳类，使得海水中重金属离子容易在体内富集∞。，并产生明显的MTs诱导，因而蛤仔可作为MTs的重要生物来源。本研究拟以菲律宾蛤仔为试验材料，先后采用正交设计及单因素设计对蛤仔内脏MT的提取条件进行优化，以便为今·基金项目：国家海洋公益性行业科研专项经费(201005012)资助收稿口期：2009—09—15；修订日期：2009—12—02作者简介：孟范平(1965一)，男．博士，教授。E-mail：fanpingrn@tom．L-x)m后利用蛤仔M

6、T监测海水重金属污染提供经济、高效的提取技术。1材料、仪器与方法1．1材料与仪器菲律宾蛤仔购于青岛南山水产品市场。海水取自青岛大麦岛沿岸，盐度32±2，pH8．O±0．2。除了苯甲基磺酰氟(PMSF)、5，5’一二硫代双一(2一硝基苯甲酸)(DTNB)购于sigma公司外，HCl、EDTA、盐酸胍、三(羟甲基)氨基甲烷(Tris碱)等试剂均为国产分析纯。所有试剂均用去离子水溶解配制。含150弘g／LCA2+的人工海水由400和￡L750mg／I。CdCl2溶液加入到2L海水中配制而成。T6新世纪紫外可见分光光度计(北京普析通

7、用仪器有限责任公司)；电子恒温水浴锅(天津市泰斯特仪器有限公司)；PH孓3C型精密酸度计(上海理达仪器厂)；CR22GⅡ高速冷冻离心机(日本日立公司)。1．2方法1．2．1含Cd2+的海水诱导蛤仔MT选取生长健康、壳长3cm左右的蛤仔在实验室驯养2d，待其排空消化道食物，将其暴露于含150弘g／I。Cd2十的海水中，暴露容器为3个(35cm×25crnX10cm)塑料容器，每个容器饲养蛤仔70只左右，不投食，每天定时更换含相同Cd2+浓度的海水(全部)，室温，自然光照，同时利用空气泵持续充氧。诱导5d后冰上解剖取内脏，并于-

8、-80℃保存备用。中国海洋大学学报1．2．2MT提取条件优化MT的提取大致可分为匀浆与除杂两步(见图1)，因此，依次对2个阶段的条件进行优化。匀浆除杂提取液(上清i瘦)图1MT提取流程Fig．1ExtractionprocessofMT(1)匀浆过程优化Tris-HCl缓冲溶液性质稳定，与