水体碳氮比对芽孢杆菌、乳酸菌与弧菌生长、拮抗作用及菌体碳氮比的影响.pdf

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1、第43卷第1期2013年1月中国海洋大学学报PERIODICAL0FOCEANUNIVERSITYOFCHINA43(1)：034～040Jan．，2013水体碳氮比对芽孢杆菌、乳酸菌与弧菌生长、拮抗作用及菌体碳氮比的影响+高磊1，包卫洋1’2，张天文1，单洪伟1，马姓r(1．中国海洋大学海水养殖教育部重点实验室，山东青岛266003；2．扬州大学海洋科学与技术研究所，江苏扬州225127)摘要：从凡纳滨对虾养殖池塘中采集分离芽孢杆菌、乳酸菌与弧菌，并设置水体碳氮比分别为：C：N。一2、5、10、15、20共5个

2、水平。在养殖环境营养水平下研究了芽孢杆菌、乳酸菌与弧菌的生长、拮抗作用及细菌菌体碳氮比(C：NB)的变化。研究发现，较高的C：Nw适合芽孢杆菌(C：N。一15)与乳酸菌(c：Nw≥10)的生长，较低的c：Nw适合弧菌(c：N。一5、10)的生长，并且当C：N。较高时芽孢杆菌与乳酸菌对弧菌的生长具有明显的拮抗作用。因此向养殖水体和饵料中添加碳源，将环境C：N提高至超过10的水平不仅可以促进芽孢杆菌与乳酸菌的快速生长，而且可以有效抑制弧菌的繁殖。关键词：水体碳氮比；生长；拮抗作用；芽孢杆菌；乳酸菌；弧菌中图法分类号：

3、$917．1文献标志码：A文章编号：1672—5174(2013)01—034—07近年来，养殖水体恶化与病害频发已成为制约对虾养殖业持续发展的主要因素。在对虾传统精养模式中，大量投饵与单一的养殖生态系统令养殖环境十分脆弱，氨氮与亚硝氮等有害物质大量积累；大量换水将外界环境中的致病菌带入到养殖水体中，增加了疾病爆发的风险；此外，养殖后期水体氮元素的大量积累导致环境碳氮比(C：N)大大降低以至于弧菌病的爆发，这也严重影响着对虾的养殖生产[1]。向养殖水体中投放益生菌不仅可以改善养殖水体的微生态结构组成，使有益菌在水

4、体中占有主导地位，还可以改良水质，抑制有害菌的生长，但是益生菌添加技术也面临着有益菌不能长时间维持，及难以形成优势菌种等诸多问题。因此，如何促进益生菌在水体中的大量繁殖，以及加强益生菌对有害菌的拮抗作用已成为1个亟待解决的问题‘2—4

5、。通过向养殖水体中添加碳源调节水体的C：N不仅可以促进异养细菌的大量繁殖，降低氨氮与亚硝氮在水体中的积累[5’6]，还可以通过形成生物絮团为对虾提供更多的天然饵料，降低养殖成本[7]。目前国内外调节环境C：N的研究工作主要集中在改善水质及促进生物絮团形成等方面，而关于其对养殖水体中

6、主要功能菌与有害菌生长的作用却鲜有报道。本文旨在研究调节水体碳氮比(C：Nw)对芽孢杆菌、乳酸菌与弧菌生长及拮抗作用的影响，并为养殖生产中的C：N调节技术提供一定的理论依据。1材料与方法1．1实验菌株实验所用细菌于2010年7～10月采集自青岛市宝荣水产科技发展有限公司，舟山市绿源水产科技发展有限公司与湛江市恒兴水产养殖有限公司3处的凡纳滨对虾养殖池塘。将5mL水体样品或59底质样品(分离芽孢杆菌时需先将样品置于80℃水浴中10min)JJI]人到装有45mL相应液体培养基的三角瓶内，富集培养后用无菌海水适当稀释

7、，取0．2mL涂布于固体培养基上，采用划线分离法对菌株进行分离，连续划线培养至纯。芽孢杆菌的初步鉴定采用孔雀绿染色法[8]，乳酸菌的初步鉴定采用脱脂乳培养法[9]，弧菌的初步鉴定采用氧化酶法[10

8、。1．2培养基配制芽孢杆菌的培养使用LB培养基[1阳；乳酸菌的培养使用MRS培养基[121；弧菌的培养使用TCBS固体培养基与碱性蛋白胨液体培养基[13-14]。C：N梯度培养基的配置：将以上3种培养基(LB培养基、MRS培养基、碱性蛋白胨液体培养基)用无菌海水稀释至养殖环境营养水平(TOC=20mg／L)E15]，并

9、通过添加碳源(葡萄糖)或氮源((NH。)。S04)，将培养基的C：N分别调节至2、5、10、15、20。*基金项目：国家科技支撑项目(201lBADl3810)；公益性行业(农业)科研专项(201103034)资助收稿日期：201卜11—22；修订日期：2012—03—09作者简介：高磊(1985一)，男，博士生。E-mail：seamas—gao@yahoo．com．cn**通讯作者：E-mail：mashen@OUC．edu．cn1期高磊，等：水体碳氮比对芽孢杆菌、乳酸菌与弧菌生长、拮抗作用及菌体碳氮比的影响

10、351．3菌株16SrDNA序列鉴定采用大连宝生物科技有限公司DNA提取试剂盒提取菌株的基因组DNA，以基因组DNA为模板采用细菌通用引物对，正向引物27f：5LAGAGTTTGATC(c／A)TGGCTCAG-37，反向引物1492r：5，-TACGG(C／T)TACCTTGTTACGACTT一37，进行16SrDNA的PCR扩增。PCR反应条件为：最初变性95℃5mi