ptsG敲除对重组大肠杆菌碳氮代谢的影响.pdf

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1、分类号：Ｑ９３学校代码：１０６９７密级：公开学号：２０１２２０７２４ｘ＾９ｏ２ｊ＾ＮｏｒｔｈｗｅｓｔＵｎｉｖｅｒｓｔｉｙ硕士字位ｉ２文ＭＡＳＴＥＲ＇ＳＤＩＳＳＥＲＴＡＴＩＯＮｐｔｓＧ敲除对重组大肠杆菌碳氮代谢的影响学科名称：生物化工作者：吕忠成指导老师：骆艳娘教授西北大学学位评定委员会二—０五年西北大学学位论文知识产权声明书本人完全了解西北大学关于收集。、保存、使用学位论文的规定学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版。本人允许论文被查阅和借阅。本人授权西北大学可以将本学位论文的全部或部分内

2、容编入有关数据库进行检索，可以釆用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。同时授权中国科学技术信息研宄所等机构将本学位论文收录到《中国学位论文全文数据库》或其它相关数据库。保密论文待解密后适用本声明：学位论文作者签名：指导教师答名：货年／月名曰｝＾丨ｒ年４月ｆ曰西北大学学位论文独创性声明本人声明：所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研宄成果据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，本论文不包含其他人己经发表或撰写过的研宄成果，也不包含为获得西北大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料一。与我同工作

3、的同志对本研究所做的任何贡献均己在论文中作了明确的说明并表示谢意。＼学位论文作者签名：年“月摘要发酵过程中菌体碳氮代谢的不平衡往往会导致代谢副产物大量积累、目标蛋白产率、。过低甚至发酵过程的失败因此，本研究采用基因敲除和代谢修饰等宇段，构建了重组大肠杆菌ＢＬ２１ＡｔｏＧ以调节菌体碳氮代谢，并从转录水平和酶活水平研究了ｔｓＧ基；ｐ因敲除对葡萄糖代谢和氮代谢的影响。研究结果表明：基因敲除不仅直接影响葡萄。ｃ－Ｃｒ糖的转运，并间接地影响了葡萄糖的代谢由于…基因敲除诱导全局调控子ＡＭＰｐ’＇的形成－ｓ，且ｃＡＭＰＣｒｐ和Ｃｒａ相互调控，ｐｔ

4、Ｇ敲除显著增强两酮酸激酶和憐酸稀醇式丙酮酸幾化酶的活性，且憐酸稀醇式两酮酸幾化酶的编码基因的转录水平提高了１．２３倍一。这些变化使得重组大肠杆菌以种更加平衡的方式利用葡萄糖，乙酸的产量明显降低，的转录水平是亲本菌株的０．３０倍，乙酸积累量降低了约７６．３％。对于氮代谢，敲除对它的作用类似于降低碳氮比。为了与降低了的碳通量相匹配，谷氨醜胺合成酶的酶活降低，而低亲和力的谷氨酸脱氢酶的酶活提高并且ｇＷ的转录水平也相应提高（亲本菌株的１．８８倍）。在ＪｔｅＧ敲除菌中，谷氨酸脱氢酶成为氮素同化的主要途径以／匹配葡萄糖的代谢。在Ｍ９改良培养基中不同碳源（葡

5、萄糖、木糖、混合糖）培养条件下，葡萄糖为单—碳源时，敲除可提高目标蛋白表达（提高了１７．４％），敲除菌的蛋白表达量一为０．２７ｇ／Ｌ，亲本菌株蛋白表达量仅为０．２３ｇ／Ｌ；木糖为单碳源时，敲除没有对代ｒ谢和蛋白表达产生明显的影响，ｓＧ敲除菌的蛋白表达量为０．１８／Ｌｐｇ，亲本菌株的目标蛋白表达量为０．１９ｇ＾；葡萄糖木糖混合糖为碳源时，敲除使菌体能够同时利用葡萄糖和木糖，可利用碳源范围增大，并促进了目标蛋白的表达，；？ｆ力敲除菌的蛋白表达量为０．２０ｇ／Ｌ，亲本菌株的蛋白表达量仅为０．１８ｇ／Ｌ（提高了１１．１％）。关键词；基因敲除，酶活

6、，焚光定量ＰＣＲ，混合糖，类人胶原蛋白ＩＡｂｓｔｒａｃｔＩｔｗａｓｗｅｌｌｋｎｏｗｎｔｈａｔｔｈｅｕｎｂａｌａｎｃｅｄｍｅｔａｂｏｌｉｓｍｓｏｆｃａｒｂｏｎａｎｄｎｉｔｒｏｇｅｎｕｓｕａｌｌｙｒｅｓｕ－ｔｔｔｌｔｅｄｉｎｈｉｈａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎｏｆｂｒｏｄｕｃｔｓｌｏｗｉｅｌｄｏｆｈｅｔａｒｅｒｏｄｕｃｔｓａｎｄｅｖｅｎｈｅｇｙｐ，ｙｇｐ，－ｍｅｔａｂｏｆａｉｌｕｒｅｏｆｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎｒｏｃｅｓｓ．Ｉｎｔｈｉｓｗｏｒｋｅｎｅｋｎｏｃｋｏｕｔａｎｄｌｉｃｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ

7、ｗｅｒｅｐｇｔｔｔＥｉｎｔｒｏｄｕｃｅｄｔｏｂａｌａｎｃｅｔｈｅｍｅａｂｏｌｉｓｍｓｏｆｃａｒｂｏｎａｎｄｎｉｔｒｏｇｅｎａｎｄｈｅｒｅｃｏｍｂｉｎａｎ．ｃｏｌｉＢＬ２１３．７ＡｐｔｓＧｗａｓｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ．ＴｈｅｅｆｆｅｃｔｓｏｆｐｔｓＧｄｅｌｅｔｉｏｎｏｎｇｌｕｃｏｓｅｍｅｔａｂｏｌｉｓｍａｎｄａｍｍｏｎｉｕｍｍｅｔａｂｏｌｉｓｍｗｅｒｅｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｄａｔｔｒａｎｓｃｒｉｔｉｏｎａｌｌｅｖ