欧洲鳗鲡肝肾病病原菌的分离与鉴定.pdf

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1、第40卷第1I期2010年11月中国海洋大学学报PERIODICALOF()CEANUNIVERSITYOFCHINA40(11)：051～056NOV．．2010研究简报欧洲鳗鲡肝肾病病原菌的分离与鉴定+吴斌1，樊海平r，曾占壮1，张新艳1，王凡2(1．福建省淡水水产研究所。福建福州350002；2．福建省水产技术推广总站，福建福州350003)摘要：患肝肾病的养殖欧洲鳗鲡(Anguillaanguilla)出现肝、肾肿大，且肝脏具白色溃疡灶的症状。从肝脏中分离、纯化到优势细菌．定名AI，60306NAl。人工感染试验证实：向欧洲鳗鲡腹腔内注射1．0×108cfu／ml，菌株悬液．实验

2、鱼死亡率达100．o％；注射1．0×107cfu／mL。死亡率为60．0％；形态学观察、API20E细菌鉴定试剂盒鉴定实验证明菌株AL60306NAl有动力、拥有革兰氏反应阴性、氧化酶阴性、Hz【五酶阳性、兼惟厌氧、发酵葡萄糖产酸产气、不发酵蔗糖和蜜二糖及L一阿拉伯糖、赖氨酸脱羧酶研I性、柠檬酸盐弱阳性、产生硫化氢和吲哚、MR阳性和典型的8一溶血等特征；16SrRNA特异性基因分析鉴定实验说明克隆的AL60306NAl16SrRNA基冈部份序列为1507bp、与迟缓爱德华氏菌(AB050829．1)的同源性达99．7％。综合I：述结果．确定该菌株为养殖欧洲鳗鲡肝肾病的病原菌．并鉴定为迟缓

3、爱德华氏菌(Edwardsiellatarda)野生型。用菌株AL60306NAl感染小白鼠实验测定该菌对小自鼠的L聩。为7．1x10jcfu／m1．，同时自该菌株PCR扩增到长度约1000hp的溶血素基因特异性片段．结果表明菌株AI。60306NAl有一定的致病力。关键词：迟缓爱德华氏菌；欧洲鳗鲡肝肾病；16SrRNA基因；溶血素基因中图法分类号：$96文献标志码：A文章编号：1672—5174(2010)1l一051—06迟缓爱德华氏菌(Edwardsiellatarda)是牙鲆、罗非鱼、斑点义尾鲷、地图龟、牛蛙等多种水产养殖动物的致病菌u‘5j，也是日本鳗鲡的重要致病菌，韩先朴、卢

4、全章、陈吕福报道J，迟缓爱德华氏菌引起的日本鳗鲡肝肾病¨。8]，董传甫曲一等研究表明迟缓爱德华氏菌足日本鳗鲡败血腹水病病原菌之一；余露军L㈨-等对混合感染迟缓爱德华氏菌与创伤弧菌的FI本鳗鲡进行病原菌的分离与鉴定；周凯u1]从患红头病的欧洲鳗鲡中分离鉴定出了迟缓爱德华氏菌。2006年3月，福建省长乐市某养殖场发生欧洲鳗鲡大量死亡。病害发生时水温约20℃，病鳗症状为游动缓慢，不摄食。胸鳍、臀鳍、背鳍充血，肛门红肿；解剖发现肝、肾明显肿大，有多个白色结节状病灶，解剖病灶为化脓性溃疡灶，胃部充满黏液、肠道充血，与日本鳗鲡肝。肾病症状相似。本文从具典型症状的欧洲鳗鲡肝脏中分离并确认了病原菌，对分

5、离菌株进行了毒力测试并扩增了溶血素基因。现将研究结果报道如下。1材料与方法1．1试验动物小白鼠购至上海斯莱克实验动物有限责任公司(SI，AC)：健康欧洲鳗鲡购自福建省长乐市某养殖场，体质量为(80±10)g，塑料袋充氧运同实验室。于水温25～28℃的水族箱不投饵、连续充气暂养，稳定饲育1周后供实验用。1．2试剂与培养基PCR试验所用buffer、dNTP、Taq酶、PCR产物胶同收试剂盒、pMDl8一T克隆试剂盒、DNAMarker均购自大连TAKARA宝生物公司；16SrRNA引物合成、测序由上海鼎安测序公司完成；API20E细菌鉴定试剂盒购自法国生物梅咀埃股份有限公司；血琼脂、胰蛋[

6、j胨、酵母浸粉、琼脂糖购自厦门泰京生物技术公司；普通营养培养基购自北京陆桥公司‘12】。1．3病原菌的分离、纯化取活的、具有肝、肾肿大和结节状白点症状的病鱼，无菌生理盐水冲洗体表3遍，无菌条件下解剖后，用接种环自肝脏、脾脏和肾脏处取样，NA培养基平板划线涂布，30℃恒温培养24～48h后，挑取形态一致的优势单菌落进一步划线。获得纯培养后，将菌接种到营养肉汤液体培养内，30℃恒温培养24h，加无菌甘油混匀，-80℃保存备用。1．4人工感染试验取-80℃保存的菌株接种NA平板，30℃培养·基金项目：福建省科技计划项目(2007N0014)；福建省发改委“水产养殖动物常发病原菌免疫金标快速诊断

7、试纸条的研发”项目(闽发改高技[20081796)；福建省海洋与渔业厅“水产动物常发病原菌的金标块速诊断试纸条研发”项目(闽财指r2010]1031)资助收稿日期：2010-03—39；修订日期：2010—05—25作者简介：吴斌(1978一)．男，硕J：，工程师。主要从事水产病害分子免疫学研究。TeL：0591—83732002；E-nmil：wubinfire@126．cor／l·★通讯作者：E-mail：fanhaipingl