同一等位基因复合杂合突变导致的I型遗传性抗凝血酶缺陷症.pdf

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1、上海交通大学硕士毕业论文引言血液在血管壁中的正常流动依赖于凝血系统，抗凝系统和纤溶系统三者之间的[1]动态平衡。生理情况下，当血管内产生局部凝血，体内的抗凝和纤溶系统会很快将之清除。病理情况下，由于遗传性或获得性凝血因子或抗凝因子缺陷，会造成凝血与抗凝失衡，导致出血或血栓形成，目前，一般认为体内主要存在三大天然抗凝系统，即抗凝血酶（antithrombin,AT）系统、蛋白C（proteinC,PC）系统、组织因子途径抑制物（TFPI）和其他抗凝物质（图1）。AT，曾称为抗凝血酶Ⅲ(antithrombinⅢ，ATⅢ)，是人体抗凝系统的主要因子之一，具有肝素辅因子活性，主要由

2、肝细胞合成。AT前体中含有32个氨基酸（aa）-1+1的信号肽，在Cys-His间的肽键被切开后分泌至血浆中，形成相对分子质量为58200的成熟AT蛋白，由432个aa组成，其中有6个半胱氨酸残基形成3个分子内二硫键，分别为Cys8-Cys128、Cys21-Cys95和Cys247-Cys430，其中Cys8-Cys128是AT肝素辅因子活性所必需，也是肝素结合位点保持完整性所必需的；另有4个糖[2，3]基化位点，分别是Asn96、Asn135、Asn155和Asn192。AT是丝氨酸蛋白酶抑制物（serpins）超家族成员，其成员结构特点是含有3个β折叠(A，B和C)，9

3、个α螺旋和1个反应中心环（reactivecenterloop，RCL）。在正常血循环中存在2种形式的AT：α-AT和β-AT，血浆中90%的AT以α-AT形式存在，它是反应中心环中的P14和P15插入β折叠结构A中的一种AT结构，此结构对凝血酶和活化因子Ⅹ(FⅩa)的抑制较弱。β-AT是P14和P15在β折叠结构A中展开的一种AT结构，对FⅩa抑制能力比α-AT增加300倍,是凝血酶的主要抑制物，同时对其他丝氨酸蛋白酶如FⅨa、FⅪa和FⅫa等凝血因子以及纤溶酶、胰[4]蛋白酶和激肽释放酶等的活性也有抑制作用。1上海交通大学硕士毕业论文图1.凝血途径及主要抗凝蛋白Figur

4、e1.Pathwayofbloodcoagulationandanticoagulation图2.3种形式抗凝血酶-肝素戊糖复合物结构比较（A）天然体（B）潜在体（C）中间体Figure2.Comparisonofthestructuresoftheantithrombin-heparinpentasaccharidecomplexinnative,latentandintermediateforms(OlsonS.T.etal.Biochimie2010；92(11):1587-1596)2上海交通大学硕士毕业论文[5]AT有两个重要的功能区，一个是位于N端的肝素结合区，一

5、个是位于C端的反应位点。AT反应位点在P1(Arg393)和P1’(Ser394)位，P1通过与凝血酶活性中心的Ser结合，形成稳定的AT-凝血酶复合物，而灭活凝血酶。在循环血液中，AT的浓度大约为2.3μM，这些AT的抗凝活性比较弱，只有在与特殊的戊糖（pentasaccharide）序列（存在于用于治疗的肝素和暴露的血管壁中的硫酸肝素分子中）结合后，AT构象发生改变，反应中心环（RCL）暴露，才可有效的发挥抗凝作[6]用。AT与肝素的结合，是AT抗凝功能中的重要一环，在肝素存在下，AT的抗凝[7]作用可以增加数千倍。对于FⅩa和FⅨa，肝素既能通过促进AT-肝素-蛋白酶复

6、合物(Michaeliscomplex)的稳定而加速AT对其的灭活，肝素还能通过介导AT变构激活（allostericactivation）而发挥其抗凝作用。在肝素的参与下，AT与FⅩa和FⅨa结合的阻力[8]减小，并且促进AT反应中心环上的外结合位点（exosite）与FⅩa和FⅨa的作用。[9]Izagurirre等研究认为Tyr253和Glu255是外结合位点关键因子，能与FⅩa和FⅨa上的Arg150特异结合,凝血酶由于缺乏Arg150而无法参与该反应。AT蛋白分子与肝素结合的区域主要有2个，分别位于41～49aa和107～156aa，即AT蛋白的N端、A螺旋的N端、

7、D螺旋及其D螺旋N端环结构，折叠在一起形成[10-12]高度碱性的戊糖结合部位（图3）。这些区域中带正电荷的碱性残基包括N端的Lys11、Arg13,A螺旋的Arg46、Arg47,D螺旋的Lys114、Lys125和Arg129，[13]通过离子键和氢键和带负电荷的肝素戊糖相互作用。其中，Lys114、Lys125和Arg129在AT与戊糖结合中最为重要，且以相互协同的方式建立静电作用网络介导[8]AT与戊糖间的作用，Lys11、Arg13、Arg46和Arg47所起的作用则较小。3上海交通大学硕士毕