荧光定量PCR技术培训班讲座.pdf

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1、实时荧光定量PCR技术原理、应用及实践RealtimeQuantitativePCR(RealtimeQuantitativePCR)北京康为世纪生物科技有限公司公司简介成立于2007年10月31日集研发、生产、销售、客户服务为一体的生物技术产业公司立志打造高品质生物试剂产品链和技术服务链，成为生命科学研究领域的问题解决专家。2北京康为世纪生物科技有限公司康为世纪生物科技有限公司我们的客户我们的合作伙伴北京大学、清华大学、完善的产品线一站式服务平台复旦大学实验设计平台中国科学院、军事医学分子生物学分子生物学平

2、台科学院全系列产品301医院、协和医院、蛋白表达与纯化蛋白质学产品上海瑞金医院平台华大基因、诺华制药免疫学相关产品抗体制备纯化平台免疫学检测平台3实时荧光定量PCR技术原理、应用及实践RealtimeQuantitativePCR(RealtimeQuantitativePCR)北京康为世纪生物科技有限公司基本原理Companyname主要内容1Real-timeqPCR的基本概念2Real-timeqPCR的定量原理3Real-timeqPCR的检测方法4Real-timeqPCR的解析方法Companyna

3、mePCR：基本原理Denaturation:94–96°C基本要素：•TemplateAnnealing:50–65°C•Primers•DNApolymeraseExtension:•dNTP,N=A,G,CorT70–75°CPCR：基本原理S形曲线，具有平台效应•理想的PCR反应：N=N*2n0•实际的PCR反应：N=N*(1+En)n0•n：扩增反应的循环次数N：第n次循环后的产物量•N：初始模板量0Ex：扩增效率Companyname与普通PCR的对比终点检测法同一个样本进行96次重复终点定量起点定量终点定量检

4、测：起点定量检测：--终点产物量经过PCR放大的DNA量--起点量是样本中原来的DNA量--不恒定，误差大--具有重现性，误差小--“生成了500，0000，0000个拷贝”--“加入了500个拷贝”Companyname确定模板初始数量‘real-time’使qPCR成为可能扩增曲线（primarycurve）荧光基团荧光检测元件扩增曲线：随着PCR反应的进行，扩增产物不断累积，荧光信号强度不断增加。每经过一个循环，收集一次荧光信号，通过荧光强度的变化监测扩增产物量的变化，从而得到一条扩增曲线图。横坐标：扩增循环数（Cy

5、cle）；纵坐标：荧光强度Companyname荧光阈值（threshold）基线（baseline）：一般以PCR反应前15个循环的荧光信号作为本底信号荧光阀值（threshold）：扩增曲线上人为设定的一个值--缺省设置是PCR反应前3-15个循环荧光本底信号标准偏差的10倍--手动设置时，要大于样本的荧光背景值和阴性对照的荧光最高值--指数期的最初阶段CompanynameCt值(CycleThreshold)www.themegallery.comCt值：PCR扩增过程中，扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时，荧光值所

6、对应的PCR循环次数。起始模板量基线阈值Ct值CompanynameCt值(CycleThreshold)www.themegallery.comCt值的特点：相同模板进行96次扩增，平台期DNA拷贝数波动很大，但Ct值相对固定；Ct值则极具重现性CompanynameCt值可以确定初始模板量？R=R+X(1+E)N*RnB0S第n个循环的总信号=本底信号+起始DNA数目*PCR扩增效率*单位信号强度当循环次数n=Ct时R=R+X(1+E)Ct*RCtB0S两边同时取对数得:lg(R-R)=lgX+Ctlg(1+E)+l

7、gRCtB0SCt=-lgX/lg(1+E)+lg(R-R)-lgR/lg(1+E)0CtBSCt=-klgX+b0lgX与Ct值呈线性关系0根据Ct值可以计算出样本中起始模板所含有的拷贝数起始拷贝数越多，Ct值越小。Companyname标准曲线分析10610510410310210未知.荧光强度---循环数扩增曲线初始模板量对数---Ct标准曲线标准曲线分析--对已知或未知样本进行系列浓度梯度稀释Companyname标准曲线分析y=-ax+b测定荧光定量PCR反应的有效性--线性的标准曲线：相关系数R2--扩增效率：扩

8、增效率(E)=10-1/斜率E%=(E-1)*100%--高扩增效率(90-110%)荧光定量PCR检测方法非特异性荧光标记：SYBRGreenI特异性荧光标记：水解探针：TaqMan非水解探针：MolecularbeaconCompanynameSYBRGreenI工作原理SYB