荧光定量pcr技术讲座课件

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1、荧光定量PCR技术讲座------分子生物学实验技术系列讲座Ⅲ大纲一、荧光定量PCR技术的基础理论二、引物及Taqman探针的设计三、内参基因的选择四、反应体系的优化五、实验方案的选择六、误差分析及操作规范七、实验中污染的防控八、实验结果的分析一、荧光定量PCR技术的基础理论1、荧光定量PCR技术概论荧光定量PCR技术产生并成熟于上世纪90年代，由于该技术实现了PCR从定性到定量的飞跃，能够对PCR反应的全过程进行实时监控，并且自动化程度高，所以该技术从产生到现在短短的十几年时间，在科研及检验领域获得了广泛的应用，成为分子生物学领域不可或缺的一项

2、重要技术。一、荧光定量PCR技术的基础理论1、荧光定量PCR技术概论荧光定量PCR技术是在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号随着PCR反应的积累来实时监控PCR反应的进程，并通过分析软件对PCR的反应进行检测分析的技术。系统组成：定量PCR仪、电脑、分析软件、试剂及耗材。一、荧光定量PCR技术的基础理论2、荧光定量PCR常用的三个概念扩增曲线、阈值、CT值（1）、扩增曲线及扩增曲线的两种形式左图反映的是随着PCR反应的进行相应的荧光信号的变化，比较直观，但是指数期很短；右图反映的是荧光信号的变化量的对数与PCR反应循环数的关系，从右图可知

3、，指数期很明显，在确定阈值线时具有简单明了的特点，所以很多软件都采用右图的形式，当然了，这两种实时扩增曲线可以根据实验的需要相互转换。一、荧光定量PCR技术的基础理论2、荧光定量PCR常用的三个概念（2）、阈值线在荧光定量PCR扩增的指数期，画一条线，在此直线上，所有样品的荧光强度与其本底荧光强度的差值全部相同。一、荧光定量PCR技术的基础理论2、荧光定量PCR常用的三个概念（3）、CT值PCR过程中，各样品扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时，所经过的扩增循环数。一、荧光定量PCR技术的基础理论3、荧光定量PCR的化学基础荧光定量PCR是随着PC

4、R循环的进行，以荧光信号强度的积累来实时反映PCR反应进程的。理想的荧光物质需具备以下特点：（1）、本底低（2）、荧光强度高（3）、每轮PCR反应完成后都有荧光强度的增高，而且这种荧光强度的增高和每轮循环后PCR产物的量成线性关系（4）、没有PCR产物时，没有荧光（5）、该荧光物质的受激发后其发射光的波长范围窄，各种荧光不会产生荧光的交叉干扰一、荧光定量PCR技术的基础理论3、荧光定量PCR的化学基础目前常用的几种荧光物质（1）、Taqman探针类5’端标记荧光基团，3’端标记淬灭基团，探针完整时，没有荧光，探针断裂后，在激发光的作用下，荧光基团

5、产生荧光；探针本身序列与目的基因序列互补，特异性高，退火后探针与目的基因互补序列结合，随着PCR反应的进行，在Taq酶5’---3’外切酶的作用下，探针水解断裂，荧光产生。一、荧光定量PCR技术的基础理论3、荧光定量PCR的化学基础Taqman常用的荧光基团和淬灭基团荧光基团：5’端常用荧光基团FAM标记，最佳激发光波长：494-495nm，最大发射光波长：518-520nm。淬灭基团：TAMRA、BHQ、ECLIPSE等。TAMRA本身也是一种荧光基团，激发光波长范围较宽，500—560nm，最佳激发光波长在560nm附近，对FAM基团产生的发

6、射光具有较好的吸收作用；其发射光波长较宽，560—650nm，当做多重荧光时，容易产生荧光交叉干扰，并且本底较高，故现已不常用。BHQ和ECLIPSE为非荧光物质，只是一种荧光淬灭剂，本身不会产生荧光，光吸收范围较宽，因此本底较低，作为淬灭基团较为常用，尤其在多重荧光定量PCR时常常被采用。一、荧光定量PCR技术的基础理论3、荧光定量PCR的化学基础Taqman探针的特点及应用（1）、特异性强、准确性高本身具有序列特异性，保证了所检测目的基因的特异性；其结构特点保证了其所产生的荧光强度与PCR产物的量成正比关系，因此准确性极高。（2）、对引物及试

7、剂要求不高，配套的普通引物就可以使用，普通的Taq酶就能满足实验的要求。（3）、常被用作基因含量的精确检测(精确度可达几十个拷贝)及基因表达变化的精确分析（精确度可达0.1倍的变化）。（4）、目前价格也不是太贵，2OD1000.00左右一、荧光定量PCR技术的基础理论3、荧光定量PCR的化学基础（2）、荧光染料类目前常用的荧光染料为SYBRGreenⅠ、SYBRGreenⅡ、SYTO9、HRM等。其共同性质为：（a）、结合于双链核酸的小沟处（b）、与双链DNA结合后受激产生荧光（c）、在变性条件下双链分开，荧光消失一、荧光定量PCR技术的基础理论

8、3、荧光定量PCR的化学基础荧光染料的特点及应用（1）、能够与所有的核酸双链结合，受激后产生荧光，其荧光的强度与双链核酸的含量及长度成正