实时荧光定量PCR讲座.ppt

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1、实时荧光定量PCR一、概念二、前期问题三、准备问题四、反应中问题五、反应后数据分析六、结果问题七、特殊问题八、恐怖问题九、注意事项END、信息交流概念谁会用到RealtimeqPCR？基本原理是什么？……谁会用到RealtimeqPCR？精确的DNA定量微生物检测：病毒拷贝数转基因检测：转基因拷贝数相对的DNA定量（差异）基因表达差异基本原理利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，最终精确地对起始模板定量分析阈值(Xn)：荧光扩增曲线指数扩增期的荧光强度标准（PCR扩增产物量的标准）C(t)值(n)：荧光信号（扩增产

2、物）到达阈值时所经过的扩增循环次数指数扩增期非指数扩增期扩增产物荧光曲线背景期ThresholdlineC(t)valueC(t)value18.12+/-0.04ThresholdlineC(t)valueC(t)value18.12+/-0.04C(t)value18.12+/-0.04C(t)value18.12+/-0.04浓度的对数值与循环数呈线性关系，根据样品扩增达到域值的循环数就可计算出样品中所含的模板量荧光强度---循环数曲线初始模板量对数---C(T)循环数标准曲线10410310610510210标准曲线：通过浓度梯度标准品，

3、绘制标准曲线样品结果与标准曲线比对得到精确的C(t)值(浓度)unknown104103绝对定量敏感性高:检测低拷贝数样品;区分小差异样品大范围拷贝数样品同时检测:100—1010省时有效临床检测，转基因检测，环境监测等设置内标：b-actin、GAPDH等管家基因对靶基因进行均一化：靶基因拷贝／每一个内标基因拷贝双标准曲线法含靶基因与含内标基因的浓度梯度质粒分别做标准曲线；样本靶基因与内标基因绝对浓度的换算，并均一化处理；标本间靶基因的表达水平分析2-ΔΔc(t)法标本内靶基因与内标基因Ct值比较：ΔC(t)=C(t)m-C(t)n标本间ΔC(

4、t)比较：ΔΔc(t)＝ΔC(t)1-ΔC(t)22-ΔΔc(t)计算相对定量常用荧光检测方法SYBR非特异性TaqMan特异性与扩增的片断配对化学试剂工作原理淬灭剂信号检测主要应用范围SYBRGreenI结合于双链DNA的小沟中无延伸熔解曲线分析定量和检测目标基因TaqMan水解型杂交探针（5‘-3’外切）有任何步骤SNP分析定量和检测目标基因前期问题荧光定量要多少钱？我应该选用那种荧光标记方法？…….荧光定量要多少钱？SYBR方法：＝PCR反应体系＋SYBR染料＋管子＝0.5+0.02+0.6＝1.0~1.5元TaqMan方法：＝PCR反应体

5、系＋探针＋管子＝0.5+1.5+0.6＝～3.0元Northern标记试剂盒＋膜＋同位素＋时间>10元我应该选用那种荧光标记方法？医疗检验TaqMan探针法特异准确科研SYBR方法便宜方便TaqMan探针法要求严格的相对定量准备问题双标准曲线法还是∆∆Ct法？怎么作标准品？荧光定量PCR的反应体系特殊吗？什么酶可以做？……双标准曲线法还是∆∆Ct法？相对定量方法基因表达差异目标基因，内标基因∆∆Ct只依靠Ct值用于大通量（很多基因，如芯片结果）计算简单估计性的结果要求目标基因和内标基因扩增效率都比较好双标准曲线法还是∆∆Ct法？双标准曲线法结果精

6、确对扩增效率要求不高构建目标基因与内标基因的标准品相当于两个绝对定量每次反应都要作标准曲线用什么作为内标基因？内标基因的目的：用来均一化目标基因，即保证目标基因的比较在一条水平线上最常用的内标基因β-actin，GAPDH选用的18S表达恒定并不被处理影响的基因容易扩增如何制作标准品荧光定量标准品主要用于绝对拷贝数定量包含扩增片断的质粒，或者基因组DNA步骤用设计的引物从待检测样品中扩增产物片断纯化后装入T-Easy载体，测序从菌中提取并纯化质粒，用分光光度计定量（ug/ul)如何制作标准品以Adeasy腺病毒质粒为例：一个质粒MW=36820b

7、pX2X330=2.43x1072.43x107g6.023x1023个分子=4.03x10-17g一个质粒(1copy)的质量=拷贝数1031041051061071081091010标准质粒质量4.03x10-14g4.03x10-13g4.03x10-124.03x10-114.03x10-104.03x10-94.03x10-84.03x10-7g计算出拷贝数（copies/ul）梯度稀释制作标准品（大体积稀释10ulto90ul）定量PCR，检查Ct值差异产物跑胶鉴定大小qPCR的反应体系特殊吗？什么酶可以做？类似于普通PCRSYBR

8、，抑制问题TaqMan，探针的退火普通的Taq酶都可以胜任TaqMan，5’外切酶活性反应体系的调节Mg2+，DMSOPCR反应体系SY