分子信标的构建及其应用研究进展.pdf

《分子信标的构建及其应用研究进展.pdf》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在行业资料-天天文库。

1、第31卷第1期应用化学Vo1．31Iss．12014年1月CHINESEJ0URNALOFAPPLIEDCHEMISTRYJan．2014分子信标的构建及其应用研究进展向东山翟琨(湖北民族学院。生物资源保护与利用湖北省重点实验室；化学与环境工程学院恩施445000)摘要分子信标(molecularbeacon，MB)是一种寡聚核苷酸荧光探针，其具有灵敏度高、特异性强、操作简单以及不必与未反应的探针分离即可实时检测等优点，在分子生物学和基因组学及分子医学等领域具有十分重要的应用价值。本文介绍了近年来出现的各种新型分子信标的结构及工作原理，概述了分子信

2、标技术在生命科学领域中的应用，展望了分子信标技术的发展趋势。关键词分子信标，构建，生化分析，应用中图分类号：O651文献标识码：A文章编号：1000-0518(2014)01-0011-09D0l：10．3724／SP．J．1095．2014．30116分子信标是一种寡聚核苷酸荧光探针，由Tyagi于1996年发明，具有灵敏度高、特异性强、操作简单以及不必与未反应的探针分离即可实时检测等优点，现已广泛应用于活细胞中DNA／RNA杂交分析引、聚合酶链反应的实时监测、基因突变的快速分析、DNA／RNA的定量检测“、蛋白质的定量检测、细菌及病毒检测13-

3、16]、酶降解监测”以及核酸．蛋白质的相互作用研究∞等领域。1分子信标的合成与性能参数1．1分子信标的合成及纯化方法分子信标在DNA合成仪上合成，一般采用3端荧光基团标记的控制微孔玻璃珠(controlledporeglass，CPG)为合成载体，在5端引入猝灭基团。荧光基团和猝灭基团与核酸末端的核苷酸，一般均是通过其活性基团(如一NH、一OH、一cO0H等)脱水缩合而相连¨J。合成完毕后经氨解、脱氨，离心除去CPG后取上清液即得合成粗产物，然后通过纯化即可得相应的分子信标。纯化方法主要有聚丙烯酰胺凝胶电泳法(PAGE)、毛细管凝胶电泳法(HPCE

4、)和高效液相色谱法(HPLC)等。1．2分子信标的性能参数分子信标的性能参数主要包括荧光寿命、灵敏度、检测限、稳定性、荧光背景、选择性及反应速度等。通常，一个好的分子信标应该具备荧光寿命长、灵敏度高、检测限低、稳定性好、荧光背景低、选择性好及反应速度快等性能。1．3荧光基团与猝灭基团的选择原则分子信标是基于荧光共振能量转移的原理而设计的_1J，因此选择荧光基团和猝灭基团的原则为荧光基团所发射的荧光能够被猝灭基团所吸收。也就是说，荧光基团的发射光谱与猝灭基团的吸收光谱能够重叠。荧光基团的最大发射波长与猝灭基团的最大吸收波长越靠近，荧光猝灭的效果就越好

5、，其荧光背景就越低j。2分子信标的类别2．1不同结构的分子信标2．1．1经典分子信标经典分子信标是指Tyagi于1996年最初发明的分子信标，它由茎、环、常见的有机荧光染料(如FAM、ROX和TAMRA等)及有机猝灭基团(如DABCY和BHQ等)4部分构成⋯2013-03-08收稿，2013-05-27修回，2013-06-20接受国家自然科学基金(21267009)、生物资源保护与利用湖北省重点实验室开放基金(PKLHB1110)、湖北省教育厅自然科学基金(D20131905)、湖北民族学院博士科研启动基金(MY2012B016)资助项目通讯联系

6、人：向东山，副教授；Tel／Fax：0718．8437531；E—mail：zk3100@sohu．con；研究方向：分子光谱l2应用化学第31卷(图1)。经典分子信标具有合成简单、操作容易、选择性好以及不必与未反应的探针分离即能实时检测等优点。但它在实际应用中也存在一定的局限性，主要表现在背景荧光较强、有机荧光基团易发生光漂白、荧光寿命短、斯托克斯位移小、受光源以及其它环境因素影响较大和反应速度慢致使杂交反应时间较长等缺陷。为了克服这些缺陷，通过改变经典分子信标的结构，设计了多种新的分子信标。Molecularbeacon——+Fluoropho

7、rcQ“。“。h。图1传统分子信标的工作原理Fig．1Principleofoperationoftraditionalmolecularbeacon⋯2．1．2改变猝灭基团的新型分子信标经典分子信标的背景荧光会严重影响分子信标在定量分析中的灵敏度和检测限。为了克服经典分子信标存在的背景荧光大的缺点，许多研究通过改变经典分子信标中的猝灭基团降低其背景荧光，来提高检测的灵敏度，降低分子信标的定量限。Maxwell和．^G^oc产，．)>>>)．

8、Dubertret_2用金纳米粒子作为荧光猝灭剂替代经典分子信标中的有机猝灭基团，设计了新型分子信a；，)

9、一；^标，用其对单链核酸检．测。这种分子信标的合成分2步，首先利用金氯酸(HAuC1)在还原剂作用下制备纳米金；然后将两端