分子生物学诊断技术进展.ppt

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1、分子生物学诊断技术进展张正北京大学人民医院1主要内容：分子生物学诊断技术在病原学检测中的应用简单介绍实验原理以PCR、荧光实时定量PCR、NASBA为例分子诊断技术在以下病原研究的应用进展乙型肝炎丙型肝炎结核分枝杆菌2病原学检测常用的实验室技术细胞培养与鉴定（“金标准”）、动物实验血清学、免疫学诊断技术电镜技术分子生物学诊断技术3分子生物学诊断技术方法简介1、主体技术具体方法举例循环扩增PCR（聚合酶链反应）Real-timePCR,RT-PCR，巢式PCR，复合PCRPCR-ELISA，微孔板杂交，荧光探针标记法LCR（连接

2、酶链反应）恒温NASBA（依赖核酸序列的扩增，主要用于RNA）SDA（链置换扩增术）CPT（环状探针技术）bDNA（枝链核酸信号放大系统）杂交捕获（如：检测HPV-DNA的试剂盒）4分子诊断技术方法简介2、多标靶同时检测多重PCR毛细管电泳以测序分析为基础的检测技术5分子诊断技术方法简介3、核酸杂交DNA荧光原位杂交（FISH）将标记的探针直接原位杂交到染色体或DNA纤维切片上，再用与荧光素分子偶联的单克隆抗体与探针分子特异性结合来检测DNA序列在染色体或DNA纤维上的定位。线性探针分析法（LiPA）杂交保护分析法（HPA）4

3、、质谱利用色、质谱结合PCR技术6分子诊断的功能及扩展病原的诊断和鉴别诊断病原分型病毒载量监测---个体化治疗的依据疗效及预后标志其他：病原感染中发生、发展各阶段7分子诊断的功能及扩展疾病分型及意义例如：HPV（30/100）高危---16，18，31，45低危---6，118分子诊断的功能及扩展病毒载量与治疗例1.---北京地坛医院谢尧提供9分子诊断的功能及扩展病毒载量与治疗例2.HBV---干扰素HBV<100pg/mL11/30阴转HBV>100pg/mL1/30阴转(HBeAgHBeAb)10分子诊断的功能及扩展病毒

4、载量与治疗例3.HIV病毒载量与传播15127人流行病学调查415对伴侣30个月HIV阳转22%（90/415）51人RNA<1500copies/mL全阴11分子诊断的功能及扩展病毒载量与治疗例4.血浆EBV载量与鼻咽癌复发15个二年持续缓解：0copy/mL10个复发：32250copies/mL17个随访：临床恶化前半年病毒载量升高12耐药病原的分子诊断WHO：人类死亡1/3是长期用药的毒副作用HBV的YMDD变异HIV耐药13血制品筛查300余万的血清阴性样品，分子生物学复测：HBV：47HCV：10HIV-1：2-2

5、001年剑桥资料HIV-1血清阴性而RNA阳性0.2-6.6%-Am.J.ChinAthol.200014在基础研究领域中的应用；遗传病的基因诊断和产前基因诊断：如血友病、地中海贫血等肿瘤基因和肿瘤标志物表达(mRNA)的检测；骨髓移植、器官移植供体配型选择；法医学、动植物学、古人类学、古生物学；与疾病相关的各种蛋白（细胞因子、酶、激素、受体）的基因表达的检测；药物基因组学、耐药基因的检测，等等分子生物学技术在其它领域的应用15简单介绍实验原理PCR(PolymeraseChainReaction,聚合酶链反应)荧光实时定量P

6、CR（realtimePCR）NASBA（依赖核酸序列的扩增）16PCR原理:实质就是体外基因复制技术Mg2+dCTPdGTPdUTPdATPTaqDNA聚合酶AmpErasePrimer靶序列加热变性95°C靶序列引物退火55°C引物延伸72°C17PCR循环第一步–加热变性靶序列靶序列从外周血白细胞或绒毛、羊水细胞提取的DNA约1ug，在含有适当缓冲液、引物、dNTPs（dATP、dCTP、dGTP及dTTP）等的反应混合物中，在94℃下热变性1-4分钟，使之解为单链。18PCR循环第二步–引物与靶序列退火靶序列靶序列Pr

7、imer1Primer2BiotinBiotin5’3’5’5’3’5’3’3’引物与解为单链的DNA上互补序列杂交在一起，称之为退火。55℃左右19PCR循环第三步-引物延伸靶序列靶序列Primer1Primer2BiotinBiotin5’3’5’5’3’5’3’3’TaqDNAPolymerase在DNA聚合酶催化作用下，以dNTPs为原料（底物），从引物的3’端A开始,沿着5’→3’的方向，合成每条模板的互补链，此称引物延伸。72℃左右20第1个PCR循环完成后靶序列靶序列BiotinBiotin2130次循环后靶序列

8、扩增的数量No.ofNo.AmpliconCyclesCopiesofTarget122438416532664201,048,576301,073,741,8241cycle=2Amplicon2cycle=4Amplicon3cycle=8Amplicon4cycle=1