分子生物学技术新进展ppt课件.ppt

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1、分子生物学技术新进展生命科学系二十一世纪医学发展的主要特点之一是对生命现象和疾病本质的认识逐渐向分子水平深入。最近十年，分子生物技术已成为医学领域极其有力的研究工具，基因工程技术、人类基因组计划与核酸序列测定技术、基因诊断与基因体外扩增技术、生物芯片技术、分子纳米技术在医学研究中和药物研制与开发中得到广泛应用，使得分子生物医学技术取得了突破性进展，也给医学带来了崭新的局面，分子生物技术已经成为现代医学的前沿和热点。分子生物技术概述分子生物技术也称之为生物工程，是现代生物技术的主要标志，其内容包括基因工程技术、细胞工程技术、DNA测序技术、DNA芯片技术、酶工程技术等。重

2、组DNA技术是现代分子生物技术发展中最重要的成就之一，也是基因工程(GeneEngineering)的核心技术。重组DNA技术的发展史年G.J.Mendel的豌豆杂交试验1944年O.T.Avery的肺炎球菌转化实验1973年美国斯坦福大学的科学家构建第一个重组DNA分子1977年美国南旧金山由博耶和斯旺森建立世界上第一家遗传工程公司，专门应用重组DNA技术制造医学上重要的药物。1980年开始建造第一家应用重组DNA技术生产胰岛素的工厂1997年英国罗林研究所成功的克隆了多莉是人类根据需要选择目的基因（DNA片段）在体外与基因运载体接合成具有自我复制能力的DNA分子——

3、复制子(replicon)，继而通过转化或转染入另一细胞或生物体内，然后筛选出含有目的基因的细胞，再进行扩增提取，获得大量重新组合的DNA分子，也称基因克隆或DNA克隆。(常用的载体有：质粒，λ噬菌体，粘粒，BAC，YAC，PI等)。重组DNA技术（RecombinantDNATechnique）1、分离纯化目的基因2、目的基因+vector=重组DNA分子3、重组DNA分子导入受体细胞，并在其内增殖。4、筛选含有重组DNA的细胞——细胞克隆（cellclone），将转化的细胞置于琼脂表面，以刺激细胞克隆生长，这些细胞是由单个细胞形成的遗传相同的细胞群体，故称细胞克隆。

4、再将每个克隆移至液体培养基中进行扩增。5、分离重组DNA克隆：即收获扩增的培养细胞，并选择分离重组DNA。基本原理与过程：以质粒为载体的DNA克隆过程上述细胞的克隆系统可直接导入的目基因扩增，获得足够量的目的基因来进行结构与功能的研究。重组DNA技术的另一目的是获得基因重组后的产物——RNA，蛋白质。将目的基因与表达载体重组，导入宿主细胞进而表达出相应的基因产物（蛋白）。如胰岛素，干扰素；生产疫苗的抗原和特异的抗体等。重组DNA技术的目的重组DNA和分子克隆的几种方法：（依目的基因的来源）1、从基因组中分离目的基因在细胞中克隆2、由特定mRNA逆转录合成cDNA后再进

5、行克隆3、化学合成目的基因进行克隆4、PCR体外扩增目的片段进行克隆PCR体系基本组成成分和步骤模板DNA特异性引物耐热DNA聚合酶dNTPsMg2+变性95˚C延伸72˚C退火Tm-5˚C聚合酶链反应（PolymeraseChainReaction）5Primer15Primer2Cycle2Cycle1555555TemplateDNA55555555555555555555555525～30次循环后，模板DNA的含量可以扩大100万倍以上。Cycle3二、PCR技术的主要用途（一）目的基因的克隆（二）

6、基因突变利用PCR技术可以随意设计引物在体外对目的基因片段进行嵌和、缺失、点突变等改造。（三）DNA和RNA的微量分析PCR技术高度敏感，对模板DNA的量要求很低，是DNA和RNA微量分析的最好方法。（四）DNA序列测定将PCR技术引入DNA序列测定，使测序工作大为简化，也提高了测序的速度；（五）基因突变分析PCR与其他技术的结合可以大大提高基因突变检测的敏感性。三、几种重要的PCR衍生技术（一）逆转录PCR技术逆转录PCR(reversetranscriptionPCR，RT-PCR)是将RNA的逆转录反应和PCR反应联合应用的一种技术，是目前从组织或细胞中获得目的基

7、因以及对已知序列的RNA进行定性及半定量分析的最有效方法。原位PCR(insituPCR)是在组织切片或细胞涂片上的单个细胞内进行的PCR反应，然后用特定标记的已知顺序核酸为探针与细胞或组织切片中核酸进行杂交，再以放射自显影的方法显示结果。现在多用生物素酶免疫方法进行检测，可检出待测DNA或RNA是否在该组织或细胞中存在。（二）原位PCR技术目前原位PCR发展最快的是荧光素标记的原位DNA杂交技术，即荧光原位杂交技术（fluorescenceinsituhybridization,简称FISH技术），是利用与荧光素分子偶联的单克隆抗体与抗