《分子生物学技术》PPT课件

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1、常用分子生物学技术的原理和应用ＤＮＡ的变性在某些理化因素作用下，DNA分子互补碱基对之间的氢键断裂，使ＤＮＡ双螺旋结构松散，变成单链，即为ＤＮＡ变性。DNA是否发生变性的常用指标是DNA对260nm波长吸光值（A260）变化。实验室最常用的方法是加热。ＤＮＡ的复性变性ＤＮＡ在适当条件下，两条互补链可重新配对，恢复天然的双螺旋构象，这一现象称为复性。热变性的ＤＮＡ经缓慢冷却后即可复性，又称退火。核酸分子杂交DNA复性时，如果将不同种类的DNA单链分子或RNA分子放在同一溶液中，只要两种单链分子之间存在一定程度配对关系，在适宜的条件下（T、离子强度），就可以在不同的分子间形

2、成杂化双链。杂化双链可以在不同的DNA分子之间、DNA与RNA之间、RNA与RNA之间。核酸研究中的应用十分广泛。探针技术探针是经过特殊标记的核酸片段，具有特定的序列，能够与待测的核酸片段互补结合，因此可用于检测核酸样品中的基因。标记物：同位素、生物素或荧光染料核酸片段：人工合成、克隆的基因组DNA、cDNA、RNA探针种类：DNA、RNA印迹技术(Blotting):将在凝胶中分离的生物大分子转移(印迹)在固相化介质上并加以检测分析的技术。(1)DNA印迹:Southernblotting(2)RNA印迹:Northernblotting(3)蛋白质印迹:Western

3、blotting印迹技术基本原理凝胶电泳转移杂交放射自显影或化学显色Southernblotting（DNA印迹技术）组织或细胞中基因组DNA经限制性内切酶消化后进行琼脂糖凝胶电泳，将含有DNA区带的凝胶放入变性溶液变性后，使胶中的DNA分子转移到NC膜上。转移完成后，加热使DNA固定于NC膜上，用于杂交反应可进行DNA印渍。主要用于：基因组DNA定性和定量分析；亦可用于分析重组质粒。RNA印迹技术:Northernblotting与DNAblotting（Southernblotting）原理相同检测RNA无需限制性内切酶切割用途：已知的特异mRNA表达水平；比较

4、不同组织或细胞的同一基因表达情况蛋白质印迹（WesternBlotting）1.蛋白质样品2.聚丙烯酰胺凝胶电泳3.电转移蛋白质至NC膜4.特异抗体做探针（一抗），碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶标记或同位素标记第二抗体。5.检测样品中特异性蛋白质的存在，细胞中特异蛋白质的半定量分析转膜ProteinHRPDABH2O21Ab2Ab洗膜、显色PCR技术（PolymeraseChainReaction）聚合酶链反应：将微量的特异的DNA片段在体外快速扩增的技术。原理:以目的DNA分子为模板，以一对分别与模板5’末端和3’末端互补的寡核苷酸片段为引物，在DNA聚合酶的作用下，按照半

5、保留复制的机制沿着模板链延伸直至完成新的DNA合成。不断重复这一过程，即可使目的DNA片段得到扩增。PCR反应体系的基本成分模板DNA，特异引物，DNA聚合酶（具耐热性）、dNTP以及含有Mg2＋的缓冲液。DNASemiconservativeReplicationPCR基本反应步骤变性：95℃模板DNA变性成为单链退火：54℃引物与模板DNA结合延伸：72℃DNA聚合酶催化DNA合成三个步骤为一个循环。新合成的DNA分子作为下一轮合成的模板，经多次循环（25～30次）后即可达到扩增DNA片段的目的。PCR的主要用途目的基因的克隆为重组DNA获得目的基因提供了简便快速的方

6、法基因的体外突变利用PCR技术可以随意设计引物在体外进行基因的嵌合、缺失、点突变等改造。DNA和RNA的微量分析一滴血液、一根毛发或一个细胞已足以满足PCR的检测需要。DNA序列分析基因突变分析PCR衍生技术反转录PCR技术mRNA反转录生成cDNA,cDNA为模板PCR扩增原位PCR技术在组织切片或细胞涂片单个细胞内PCR反应，再进行原位杂交实时PCR技术引入一对特殊的荧光标记引物探针，5’端有一个荧光报告分子，3’端有一个荧光淬灭分子；PCR进行时Taq酶遇到荧光探针可以酶切，根据荧光信号进行定量核酸序列分析1965年RobertHolly用了7年完成了酵母丙氨酸-t

7、RNA的76个核苷酸的序列测定DNA序列分析仪24小时内可完成约10000个碱基序列的测定工作DNA链末端合成终止法（Sanger法）四种2’,3’-双脱氧核苷酸（ddNTP）代替部分脱氧核苷酸（dNTP）作为底物进行DNA合成反应。依据是ddNTP核糖的第三位位碳原子上不含羟基，不能与下一核苷酸反应形成磷酸二酯键，致使DNA合成反应终止。模板分四组，反应一定时间后，每一管内加入四种ddNTP中的一种，如果ddNTP:dNTP的比例适当，即可获得在不同部位终止反应的大小不同的DNA链，经聚丙烯酰胺凝胶电泳分离这些片段，放射自显