《分子生物学技术》PPT课件

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1、分子生物学技术的原理及应用ThePopularTechnologyinMolecularBiology:PrincipleandApplication一、分子杂交与印迹技术MolecularHybridization&BlottingTechnology核酸分子杂交(nucleicacidhybridization)在DNA复性过程中，如果把不同DNA单链分子放在同一溶液中，或把DNA与RNA放在一起，只要在DNA或RNA的单链分子之间有一定的碱基配对关系，就可以在不同的分子之间形成杂化双链(heteroduplex)。复性RNADNA探针(prob

2、e)一小段用同位素、生物素或荧光染料标标记其末端或全链的已知序列的多聚核苷酸，与固定在NC膜上的核苷酸结合，判断是否有同源的核酸分子存在。（一）分子杂交斑点杂交：dotblottingDNAarrayDNAchips蛋白质芯片原位杂交：细胞原位杂交组织原位杂交DNA点阵目录目录是将高度密集排列的蛋白分子作为探针点阵固定在固相支持物上，当与待测蛋白样品反应时，可捕获样品中的靶蛋白，再经检测系统对靶蛋白进行定性和定量分析的一种技术。蛋白质芯片(proteinchip)（二）转移印迹技术（一）DNA印迹技术(Southernblotting)用于基因组DN

3、A、重组质粒和噬菌体的分析。（二）RNA印迹技术(Northernblotting)用于RNA的定性定量分析。（三）蛋白质的印迹分析(Westernblotting)用于蛋白质定性定量及相互作用研究。分子杂交实验①②③目录三种印迹技术的比较放射自显影照片目录二、聚合酶链反应PolymeraseChainReaction模板DNA特异性引物耐热DNA聚合酶dNTPsMg2+（一）PCR反应条件5Primer15Primer2Cycle2Cycle1555555TemplateDNA55555555（二）基本工作原理目录C

4、ycle3555555555555555525～30次循环后，模板DNA的含量可以扩大100万倍以上。目录（三）PCR的基本反应步骤变性95˚C延伸72˚C退火Tm-5˚C1.目的基因的克隆2.基因的体外突变3.DNA和RNA的微量分析4.DNA序列测定5.基因突变分析（四）PCR的主要用途（五）几种重要的PCR衍生技术1.反转录PCR技术2.原位PCR技术3.实时PCR技术实时PCR技术原理目录三、核酸序列分析NucleicAcidSequenceAnalysis核酸序列分析的方法：化学裂解法(Maxam-Gillb

5、ert法)DNA链的末端合成终止法(sanger法)（一）化学裂解法(Maxam-Gillbert法)基本原理基于某些化学试剂可以使DNA链在1个或2个碱基处发生专一性断裂的特性，精确地控制反应强度，使一个断裂点仅存在于少数分子中，不同分子在不同位点断裂，从而获得一系列大小不同的DNA片段，将这些片段经电泳分离。分析前，用同位素标记DNA的5´末端，经放射自显影即可在X胶片上读出DNA链的序列。基本步骤将DNA的末端之一标记上放射性同位素（32P）再对DNA样品分别进行多组具碱基特异的、随机的不完全的化学修饰在修饰碱基位置化学法断开DNA链通过具有可

6、分辨长短仅一个核苷酸之差的PAGE电泳，将DNA断裂片段按分子大小分开根据放射自显影胶片上显示的末端标记片段的分布情况，直接读出DNA的核苷酸序列。5'HO-GATCGGACCT3′↓标记5’32P-GATCGGACCT3′↓不完全修饰修饰G修饰G和A修饰T和C修饰C↓化学裂解↓电泳分离—G——G+A——T+C——C—全长核酸————————————————————————————————（二）DNA链末端合成终止法目录（三）DNA自动测序采用荧光替代放射性核素标记是实现DNA序列分析自动化的基础。用不同荧光分子标记四种双脱氧核苷酸，然后进行Sang

7、er测序反应，反应产物经电泳（平板电泳或毛细管电泳）分离后，通过四种激光激发不同大小DNA片段上的荧光分子使之发射出四种不同波长荧光，检测器采集荧光信号，并依此确定DNA碱基的排列顺序。DNA自动测序结果举例目录四、基因文库GeneLibrary基因组DNA文库(genomicDNAlibrary)cDNA文库(cDNAlibrary)基因文库(genelibrary)是指一个包含了某一生物体全部DNA序列的克隆群体。基因组DNA文库目录第一轮筛选第二轮筛选第三轮筛选基因组文库筛选结果举例五、遗传修饰动物模型的建立及应用TheEstablishmen

8、tandApplicationofHeredity-ModifiedAnimalModel转基因技术采用基因