分子生物学技术 课件.ppt

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1、分子生物学常用实验技术ThePrincipleandApplicationofCommonUsedTechniquesinMolecularBiology生物化学与分子生物学教研室徐文弟2010.9.23现代分子生物学遗传中心法则与组学遗传信息传递的基本规律分子生物学研究内容生物大分子结构与功能生物大分子的相互作用分子生物研究技术蛋白质、核酸分析技术蛋白质-蛋白质相互作用蛋白质-核酸相互作用工具酶的应用遗传中心法则基因信息的流向、基因表达的环节与调控的不同水平；DNA所占的中心位置；RNA是信息表达的体现；蛋白质执行生物学功能。基因

2、工程的基本原理!生命的起源？基因组、转录组、蛋白质组、代谢组之间的关系基因组学是基础、转录组学是信息、蛋白质组学是功能、代谢组学是结果。整合也是创新方法的结合形态与机能研究的结合中西医的结合21世纪分子医学发展的主要领域分子诊断基因治疗生物工程药物第一讲蛋白质的分离、纯化、鉴定和结构分析Isolation,Purification,IdentificationandStructuralAnalysisofProteins一、丙酮沉淀、盐析及免疫沉淀:是常用的蛋白质沉淀方法使用丙酮沉淀时，必须在0～4℃低温下进行，丙酮用量一般10倍于

3、蛋白质溶液体积。蛋白质被丙酮沉淀后，应立即分离。除了丙酮以外，也可用乙醇沉淀。盐析(saltprecipitation)是将硫酸铵、硫酸钠或氯化钠等加入蛋白质溶液，使蛋白质表面电荷被中和以及水化膜被破坏，导致蛋白质沉淀。+++++++带正电荷的蛋白质－－－－－－－－带负电荷的蛋白质在等电点的蛋白质水化膜++++++++带正电荷的蛋白质－－－－－－－－带负电荷的蛋白质不稳定的蛋白质颗粒酸碱酸碱酸碱脱水作用脱水作用脱水作用溶液中蛋白质的聚沉将某一纯化蛋白质免疫动物可获得抗该蛋白的特异抗体。利用特异抗体识别相应的抗原蛋白，并形成抗原抗体复

4、合物的性质，可从蛋白质混合溶液中分离获得抗原蛋白。免疫沉淀法（immunoprecipitation）二、透析及超滤法:可清除蛋白质溶液中的小分子化合物利用透析袋把大分子蛋白质与小分子化合物分开的方法。应用正压或离心力使蛋白质溶液透过有一定截留分子量的超滤膜，达到浓缩蛋白质溶液的目的。超滤法透析(dialysis)三、电泳:是蛋白质分离与鉴定的常用方法电泳(elctrophoresis)蛋白质在高于或低于其pI的溶液中为带电的颗粒，在电场中能向正极或负极移动。这种通过蛋白质在电场中泳动而达到分离各种蛋白质的技术,称为电泳。根据支撑物

5、的不同，可分为薄膜电泳、凝胶电泳等。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，常用于蛋白质分子量的测定。等电聚焦电泳，通过蛋白质等电点的差异而分离蛋白质的电泳方法。双向凝胶电泳，蛋白质组学研究的重要技术。几种重要的蛋白质电泳：蛋白质的二维电泳二维电泳图四、应用相分配或亲和原理：可将蛋白质进行层析分离待分离蛋白质溶液（流动相）经过一个固态物质（固定相）时，根据溶液中待分离的蛋白质颗粒大小、电荷多少及亲和力等，使待分离的蛋白质组分在两相中反复分配，并以不同速度流经固定相而达到分离蛋白质的目的。层析(chromatography)离子交换层析：利用各蛋

6、白质的电荷量及性质不同进行分离。凝胶过滤(gelfiltration)：又称分子筛层析，利用各蛋白质分子大小不同分离。蛋白质分离常用的层析方法五、利用蛋白质颗粒沉降行为不同：可进行超速离心分离超速离心法(ultracentrifugation)既可以用来分离纯化蛋白质也可以用作测定蛋白质的分子量。沉降系数(sedimentationcoefficient,S)蛋白质在离心场中的行为用沉降系数表示,沉降系数与蛋白质的密度和形状相关。因为沉降系数S大体上与分子量成正比关系，故可应用超速离心法测定蛋白质分子量，但对分子形状的高度不对称的大

7、多数纤维状蛋白质不适用。六、用化学或反向遗传学方法：可分析或演绎多肽链的氨基酸序列分析已纯化蛋白质的氨基酸残基组成（离子交换层析）测定多肽链的氨基末端与羧基末端为何种氨基酸残基把肽链水解成片段，分别进行分析测定各肽段的氨基酸排列顺序，一般采用Edman降解法一般需用数种水解法，并分析出各肽段中的氨基酸顺序，然后经过组合排列对比，最终得出完整肽链中氨基酸顺序的结果。化学法溶解法二硝基氟苯法（DNP法）肼解法二甲基氨基萘磺酰氯法（Dansyl-氯法）还原成氨基醇法亮氨酸氨肽酶法细胞外氨肽酶法羧肽酶A法羧肽酶B法羧肽酶C法氨基酸和肽的末端

8、测定法通过核酸来推演蛋白质中的氨基酸序列：按照三联密码的原则推演出氨基酸的序列分离编码蛋白质的基因测定DNA序列排列出mRNA序列七、应用物理学、生物信息学原理：可进行蛋白质空间结构测定或预测通常采用圆二色光谱(circulardic