分子生物学常用技术2杂交ppt课件.ppt

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1、分子生物学常用技术凝胶电泳分子杂交技术PCR技术DNA物理图谱DNA序列测定生物芯片“基因靶向”技术RNA干扰技术分子杂交技术核酸分子杂交是在DNA变性和复性的基础上建立起来的一种分子生物学技术.其原理是具有一定同源性的两条核酸单链在一定条件下根据碱基互补的原则可以形成双链(碱基对之间非共价健形成稳定的双链).杂交（hydridization）指两个以上的分子因具有相近的化学性质(或结构互补)而在适宜的条件下特异地相互识别、结合形成杂交体（hybrid）的过程。（一）DNA变性DNA变性是指双螺旋之间氢键断裂，双螺旋解开，形成单链无规则线团

2、样DNA，称为DNA变性。变性方法：1):加热、2):DNA溶液的pH改变、3):有机溶剂等变性的DNA的特征：粘度下降、沉降速度增加、浮力上升、紫外吸收增加。（二）DNA复性变性DNA只要消除变性条件，二条互补链还可以重新结合，恢复原来的双螺旋结构，这一过程称为复性。复性后的DNA，理化性质都能得到恢复。核酸分子杂交的特点:高度特异性高度灵敏性已成为分子生物学中最常用的基本技术.广泛应用于:基因克隆的筛选酶切图谱的制作基因序列的定量和定性分析基因突变的检测等。杂交的双方:待测核酸序列+探针（probe）待测核酸序列:克隆的DNA片段未克隆

3、化的基因组DNA细胞总RNA,mRNA。核酸分子杂交核酸探针：是指用放射性核素、生物素或其他活性物质标记而便于检测的，能与特定的核酸序列发生特异性互补的已知DNA或RNA片段。基因组DNA探针cDNA探针寡核苷酸探针RNA探针等探针1、DNA探针DNA探针是最常用的核酸探针，指长度在几百碱基对以上的双链DNA或单链DNA探针。现已获得DNA探针种类很多:有细菌、病毒、原虫、真菌、动物和人类细胞DNA探针。这类探针多为某一基因的全部或部分序列，或某一非编码序列。来源:分子克隆PCR２、cDNA探针cDNA（complementaryDNA）探

4、针是指互补于mRNA的DNA分子，是由逆转录酶催化而产生的。该酶以RNA为模板，根据碱基配对原则，按照RNA的核苷酸顺序合成DNA（其中U与A配对）。无内含子和非编码序列cDNA探针是目前应用最为广泛理想的一种探针。来源:分子克隆RT-PCRDNA探针（包括cDNA探针）的优点：①:这类探针多克隆在质粒载体中，可以无限繁殖、大量制备、方法简便。②:不易降解（相对RNA而言），DNA酶活性一般能有效抑制。③:DNA探针的标记方法较成熟，有多种方法可供选择，如缺口平移，随机引物法等，能用于同位素和非同位素标记。3、RNA探针：RNA探针是一类很

5、有前途的核酸探针，由于RNA是单链分子，所以它与靶序列的杂交反应效率极高,特异性强。克隆载体体外转录(invitrotranscription)RNA探针容易降解4、寡核苷酸探针：根据已知的核酸序列，采用DNA合成仪合成一定长度的寡核苷酸片段，亦可作为探针使用。若不知核酸序列，可根据蛋白质的氨基酸顺序推倒出核酸顺序，但要考虑到密码子的兼并性。多用于克隆筛选和点突变分析。人工合成的寡核酸探针有下述优点：①短的探针比长探针杂交速度快、穿透力强。　　②可以在短时间内大量制备。③在合成中进行标记制成探针。④可合成单链探针，避免了用双链DNA探针在

6、杂交中自我复性，提高杂交效率。　　⑤寡核苷酸探针可以检测小DNA片段，在严格的杂交条件下，可用于检测在序列中单碱基对的错配。人工合成的寡核酸探针有下述优点：①短的探针比长探针杂交速度快、穿透力强。　　②可以在短时间内大量制备。③在合成中进行标记制成探针。④可合成单链探针，避免了用双链DNA探针在杂交中自我复性，提高杂交效率。　　⑤寡核苷酸探针可以检测小DNA片段，在严格的杂交条件下，可用于检测在序列中单碱基对的错配。筛选寡核苷酸针的原则：①长18～50bp，较长探针杂交时间较长合成量低；较短探针特异性会差些。　　②碱基成分：G+C含

7、量为40%～60%，超出此范围则会增加非特异杂交。　　③探针分子内不应存在互补区，否则会出现抑制探针杂交的“发夹”状结构。　　④避免单一碱基的重复出现（不能多于4个），如-CCCCC-。　　⑤一旦选定某一序更符合上述标准，最好将序列与核酸文库中核酸序列比较，探针序列应与含靶序列的核酸杂交，而与非靶区域的同源性不能超过70%或有连续8个或更多的碱基的同源，否则，该探针不能用。克隆探针：前述三种探针(DNA,cDNA,RNA)均是可克隆的，一般情况下，只要有克隆的探针，就不用寡核苷酸探针。克隆探针的优点：（1）:特异性强，从统计学角度而言

8、，较长的序列复杂度高，随机碰撞互补序列的机会较短序列少；（2）:可获得较强的杂交信号，因为克隆探针较寡核苷酸探针掺入的可检测标记基团更多。核酸探针的标记核酸探针的制备是分子杂交技