《杂交技术》PPT课件

《杂交技术》PPT课件

ID:39579436

大小:305.61 KB

页数:23页

时间:2019-07-06

《杂交技术》PPT课件_第1页
《杂交技术》PPT课件_第2页
《杂交技术》PPT课件_第3页
《杂交技术》PPT课件_第4页
《杂交技术》PPT课件_第5页
资源描述:

《《杂交技术》PPT课件》由会员上传分享,免费在线阅读,更多相关内容在教育资源-天天文库

1、3.2杂交技术3.2.1探针和探针标记一、概念1、探针((probe):带有能检测的标记物的DNA或RNA。2、探针标记:使DNA或RNA带有可检测的标记物的过程。互补的核苷酸序列通过Walson-Crick碱基配对形成稳定的杂合双链分子DNA分子的过程称为杂交。3、杂交:互补的核苷酸序列通过碱基配对形成稳定的杂合双链分子DNA分子的过程。注意:探针必须经过标记,以便示踪和检测。二、标记方法1、切口平移标记2、随机引物标记切口平移法(nicktranslation)控制DNA酶浓度,使DNA的一条链在有限的位置上大开切口,形成3'-OH和5'-P末端。E.coliDNA聚合酶Ⅰ将核

2、苷酸连接到切口的3‘羟基末端。同时该酶具有从5’→3‘的核酸外切酶活性,能从切口的5’端除去核苷酸。由于在切去核苷酸的同时又在切口的3‘端补上核苷酸,从而使切口沿着DNA链移动,用放射性核苷酸代替原先无放射性的核苷酸,即将一个个带有标记物的[α-32P]dNTP加在3'-OH末端。最合适的切口平移片段一般为50-500个核苷酸。切后平移:DNA的切口从左到右沿着DNA平移的过程。2.随机引物合成法随机引物:能与任何DNA模板的多个位点配对互补的多个不均一序列寡聚核苷酸DNA片段。随机引物合成双链探针是使寡核苷酸引物与DNA模板结合,在DNA聚合酶Klenow大片段的作用下,能在随机

3、引物的引导下以带有标记物的dNTP为原料合成新的与模板DNA互补的探针。通常产物平均长度为400-600个核苷酸。利用随机引物进行反应的优点是:(1)Klenow片段没有5‘→3’外切酶活性,反应稳定,可以获得大量的有效探针。(2)反应时对模板的要求不严格,用微量制备的质粒DNA模板也可进行反应。(3)反应产物的比活性较高,可达4×109cpm/μg探针。(4)随机引物反应还可以在低熔点琼脂糖中直接进行。3.2.2杂交blot一词,有不同翻译,有人叫“印迹法”,也有人翻译为“斑渍法”,更为普通的是直接称为Southernblot)一、种类杂交技术有固相杂交和液相杂交之分。固相杂交技

4、术目前较为常用,先将待测核酸结合到一定的固相支持物上,再与液相中的标记探针进行杂交。固相支持物常用硝酸纤维素膜(nitrocellulosefiltermembrane,简称NC膜)或尼龙膜(nylonmembrane)。固相杂交包括膜上印迹杂交和原位杂交。前者包括三个基本过程:第一,通过印迹技术将核酸片段转移到固相支持物上;第二,用标记探针与支持物上的核酸片段进行杂交;第三,杂交信号的检测。二、杂交方法(一)、斑点印迹(Dot-blot)杂交将待测核酸样品变性后直接点样在膜上,称之为斑点印迹。为使核酸牢固结合在膜上,通常还将点样后的膜进行80℃真空烘烤2h。应用斑点印迹技术,可在

5、一张膜上同时进行多个样品的检测,操作简便、快速,在临床诊断中应用较广。适合进行特定基因的定性及定量研究,但不能鉴定所测基因的分子量。(二)、Southern印迹(Southernblot)1、定义:指将DNA片段经琼脂糖凝胶电泳分离后转移到固相支持物上的过程。2、原理:将限制性内切酶对DNA样品进行酶切处理,经琼脂糖凝胶电泳将所得DNA片段按分子量大小分离,接着对凝胶进行变性处理,使双链DNA解离成单链,并将其转移到NC膜或其它固相支持物上,转移后各DNA片段的相对位置保持不变。用探针与经Southern印迹处理的DNA样品杂交,可鉴定待测DNA的大小、进行克隆基因的酶切图谱分析、

6、基因组基因的定性及定量分析、基因突变分析及限制性片段长度多态性分析(RFLP)等。3、作用:Southern杂交可用来检测经限制性内切酶切割后的DNA片段中是否存在与探针同源的序列。4、Southern印迹的操作方法(1)、毛细管转移(或虹吸印迹)。传统方法。进行毛细管转移时,DNA片段由液流携带从凝胶转移到固相支持物表面。安放装置时,在转移槽中央的平台上由下到上依次叠放变性凝胶、滤膜、一叠干的吸水纸巾;凝胶与转移缓冲液通过滤纸桥连接;滤膜上的纸巾吸水产生并维持毛细管作用,液体由于毛细管作用抽吸通过凝胶,并将DNA片段携带聚集在滤膜上。DNA片段的大小和琼脂的浓度决定了转移的速度。

7、小片段DNA(<1kb)在1小时内可从0.7%琼脂糖凝胶上几乎定量转移,而大片段DNA的转移较慢且效率较低,如大于15kb的DNA片段需要18小时而转移尚不完全。500克总物玻璃板吸水纸尼龙膜3层滤纸3层滤纸滤纸(2)、电转移。利用电场的电泳作用将凝胶中的DNA转移到固相支持物上,可达到简单、迅速、高效的目的。一般2-3小时内可转移完毕。(3)、真空印迹法这是近年来发展起来的一种简单、快速、高效的DNA和RNA印迹法。其基本原理是利用真空作用将转膜缓冲液从凝胶上层的容

当前文档最多预览五页,下载文档查看全文

此文档下载收益归作者所有

当前文档最多预览五页,下载文档查看全文
温馨提示:
1. 部分包含数学公式或PPT动画的文件,查看预览时可能会显示错乱或异常,文件下载后无此问题,请放心下载。
2. 本文档由用户上传,版权归属用户,天天文库负责整理代发布。如果您对本文档版权有争议请及时联系客服。
3. 下载前请仔细阅读文档内容,确认文档内容符合您的需求后进行下载,若出现内容与标题不符可向本站投诉处理。
4. 下载文档时可能由于网络波动等原因无法下载或下载错误,付费完成后未能成功下载的用户请联系客服处理。