生物化学教学课件 实验二.docx

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1、实验二蛋白质的含量测定——凯氏定氮法目前常用的有四种古老的经典方法:凯式定氮法，,双缩脲法(Biuret法)，Folin-酚试剂法(Lowry法)和紫外吸收法.另外还有一种近十年才普遍使用起来的新测定方法,考马斯亮蓝法(Bradford法).其中Bradford法和Lowry法灵敏度高，比紫外吸收法高10-20倍,比Biuret法高100倍以上.凯氏定氮法比较复杂,但较准确,往往以定氮法测定的蛋白质作为其他方法的标准蛋白质一、目的和要求：(1)掌握利用凯式定氮法测定生物材料中氮的含量和蛋白质的含量的方法(2)理论用于实践中:比较不同的材料中蛋白质的含量二、实

2、验原理：样品与浓硫酸共热,含氮有机物即分解产生氨,氨又与硫酸作用变成硫氨.经强碱碱化使之分解放出氨,借蒸汽将氨蒸至酸液中,根据此酸液被中和的程度可计算得样品氮的含量。三、实验准备：试剂：HCl标准溶液（0.01mol.L-1）H3BO3溶液(2%)H2SO4(浓)NaOH溶液(30%)K2SO4(固体)CuSO4.5H2O(固体)甲基红—溴甲酚绿混合指示剂仪器：凯氏烧瓶（100ml）:1个50ml容量瓶凯氏定氮装置烘箱移液管(10ml):1支酸式滴定管(10ml):1支分析天平电炉四、实验内容及方法：（一）消化液的制取准确称取干燥样品0.5g，置于凯氏烧瓶内

3、，加入0.2g(K2SO4,CuSO4.5H2O)混合物及15ml浓H2SO4，加数粒玻璃珠，缓慢加热，当硫酸分解开始放出二氧化硫白烟后，即加大火力至溶液澄清，再继续加热约1h，冷却至室温。沿瓶壁加入50ml纯水，溶解盐类，冷却，转入100ml容量瓶中，以纯水冲洗烧瓶数次，洗液并入容量瓶中，加水至刻度，摇匀。（二）、NH3的固定1、按图装好凯氏定氮装置。向蒸汽发生器中的水中加数滴甲基红指示剂、几滴H2SO4及数粒沸石在整个蒸馏过程中需保持此液为橙红色，否则补加H2SO4。接收液为20ml2%的H3BO4溶液，其中加2滴混合指示剂，接收时使装置的冷凝管下口浸入

4、吸收液的液面之下先用蒸汽洗涤整个装置,约15分钟,用含指示剂的硼酸溶液检测装置是否洗干净。如果不变色才说明洗净了.2、蒸馏:移取10.0ml样品消化液，经进样口注入反应室内，用少量水冲洗进样口，然后加入10ml30%NaOH溶液于反应室内，塞好玻璃塞，防止氨的逸出。从开始回流记时，自变色起再蒸馏4min，移动冷凝管下口使其离开接收液面。再蒸馏，用纯水洗冷凝管下口，洗液流入吸收液内。（三）NH3的标定用0.01mol.L-1HCl标准溶液滴定至暗红色为终点。五、实验作业：若测定的样品含氮量部分只是蛋白性，（如血清）则：样品的总蛋白含量（克蛋白%）=式中：A为滴

5、定样品用去的盐酸平均毫升数；B为滴定空白用去的盐酸平均毫升数；C为称量样品的克数：0.0100为盐酸的当量浓度（实际上，此项应按实验中使用盐酸的实际浓度填写）；14为氮的原子量；6.25为常数（1毫升0.1N盐酸相当于0.14毫克氮）。若样品中除有蛋白外，尚有其他含氮物质，则样品蛋白质含量的测定要更复杂一些。首先需向样品中加入三氯乙酸，使其最终浓度为5%，然后测定未加三氯乙酸的样品及加入三氯乙酸后的样品的上清液中的含氮量，从而计算出蛋白氮，再进一步算出蛋白质的含量。蛋白氮=总氮—非蛋白氮蛋白质含量（克/%）=蛋白氮×6.25