间充质干细胞培养方法.doc

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1、1.间充质干细胞MSC基木形态2.干细胞应用与干细胞调控。3.间充质干细胞MSC生长过程4.间充质干细胞MSC培养的合适气体环境5.细胞培养板的选择6.如何选川细胞培养基7.如何维持培养液pH8.血清与干细胞的培养9.胎牛血清(FBS)是否需要灭活10.细胞的细菌、真菌污染及排除11.细胞培养污染的预防12.使用胰蛋白酶时加入EDTA的目的是什么13.胶原酶的种类和选型14.胶原酶VS胰酶15.干细胞的种类和表面标记彳6.间质干细胞培养原理概述仃.间质干细胞成脂和成骨诱导分化18.干细胞老化的表现和处理19.细胞传代消化过程指导20.冷冻保护剂作用和选择21.细胞冻

2、存指导22.干细胞冷冻和复苏23.移梢•细胞的基因修饰「间充质干细胞MSC基本形态体外培养细胞根据它们在培养器皿是否能贴附于支持物上生长特征，可分为贴附型生长细胞，常表现为成纤维型细胞和上皮细胞。悬浮型细胞在培养中悬浮生长。间充质T•细胞MSCffi木形态：形态与成纤维细胞类似，细胞在支持物表面旱梭形或不规则二角形生长，细胞中央冇卵圆形核，胞质向外伸出2—3厘米个长短不同的突起。可看到细胞成螺旋状生长。2.干细胞应用与干细胞调控干细胞的调控是指给出适当的因了条件,对干细胞的增殖和分化进行调控,使之向指定的方向发展。2.1内源性调控干细胞门身仃许多调控因子可对外界信号

3、起反应从而调节其增殖和分化，包括调节细胞不对称分裂的蛋白，控制基因表达的核因子等。另外，干细胞在终末分化Z前所进行的分裂次数也受到细胞内调控因子的制约。(1)胞内蛋白对干细胞分裂的调控干细胞分裂可能产生新的干细胞或分化的功能细胞。这种分化的不对称是山于细胞本身成分的不均等分配和周围环境的作川造成的。细胞的结构蛋门，特别是细胞骨架成分对细胞的发育非常1E要。如在果幌卵巢中，调控干细胞不对称分裂的是一种称为收缩体的细胞器，包含右许多调节蛋门，如膜收缩蛋门和细胞周期索A。收缩体与纺锤体的结合决定了干细胞分裂的部位，从而把维持干细胞性状所必需的成分保留在子代干细胞中。（2）

4、转录因子的调控在脊椎动物中，转录因了对干细胞分化的调节非常巫要。比如在胚胎T•细胞的发生中，转录因了Oct4是必需的。Oct4是…种哺乳动物早期胚胎细胞表达的转录因了，它诱导表达的靶基因产物是FGF-4等生长因了，能够通过生长因了的旁分泌作用调节干细胞以及周围滋养层的进…步分化。Oct4缺失突变的胚胎只能发育到囊胚期，其内部细胞不能发育成内层细胞团。另外门血病抑制因子（LIF）对培养的小鼠ES细胞的自我更新有促进作用,而对人的成体干细胞无作用,说明不同种属间的转录调控是不完全一致的。乂如Tcf/Lef转录因了家族对匕皮干细胞的分化非常重要。Tcf/Lef是Wnt信号

5、通路的中间介质，当与P-Catenin形成转录复合物后，促使角质细胞转化为多能状态并分化为毛囊。2.2外源性调控除内源性调控外，T•细胞的分化还可受到其周囤组织及细胞外苹质等外源性内索的影响。（1）分泌因子间质细胞能够分泌许多因了，维持干细胞的增殖，分化和存活。冇两类因子在不同组织茯至不同种属中都发挥重要作用，它们是TGFP家族和Wnt信号通路。比如TGF家族中至少冇两个成员能够调节神经硏干细胞的分化。最近研究发现，胶质细胞衍生的神经营养因了（GDNF）不仅能够促进多种神经元的存活和分化，还对精原细胞的再生和分化仃决定作用。GDNF缺失的小鼠表现为干细胞数量的减少，

6、而GDNF的过度表达导致未分化的精原细胞的累积。Wnts的作用机制是通过阻止P-Catenin分解从而激活Tcf/Lef介导的转录，促进干细胞的分化。比如在线虫卵裂球的分裂中，邻近细胞诱导的Wnt信号通路能够控制纺锤体的起始点和内胚层的分化。（2）膜蛋白介导的细胞间的相互作用仃些信号足通过细胞■细胞的宜接接触起作用的。P-Catenin就是一种介导细胞粘附连接的结构成分。除此之外，穿膜蛋白Notch及其配体Delta或Jagged也对下•细胞分化仃匝要彫响。在果帅的感觉器官前体细胞，脊椎动物的胚胎及成年组织包括视网膜神经上皮、骨骼肌和血液系统中，Notch信号都起着

7、非常巫要的作用。当Notch与其配体结合时，干细胞进行非分化性增殖;当Notch活性被抑制时，干细胞进入分化程序，发育为功能细胞。（3）整合索（Integrin）与细胞外基质整合素家族是介导干细胞与细胞外基质粘附的最主要的分了。整介索与其配体的相互作用为干细胞的非分化增殖提供了适当的微环境。比如当炉整合索丧失功能时，上皮干细胞逃脱了微环境的制约，分化成角质细胞。此外细胞外基质通过调节旳整合索的表达和激活，从而影响干细胞的分布和分化方向。23干细胞的可塑性越来越多的证据表明，当成体干细胞被移植入受体中，它们表现出很强的可塑性。通常情况下,供体的干细胞在受体中分化为