DB22∕T 2984-2019 鹿粘膜病双抗夹心ELISA检测方法.pdf

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1、ICS11.220B41DB22吉林省地方标准本标准仅供内部使用不得翻印DB22/T2984—2019鹿粘膜病双抗夹心ELISA检测方法DoubleantibodysandwichELISAmethodforthedetectionofdeermucosaldisease本标准仅供内部使用不得翻印2019-05-27发布2019-06-17实施吉林省市场监督管理厅发布本标准仅供内部使用不得翻印本标准仅供内部使用不得翻印DB22/T2984—2019本标准仅供内部使用不得翻印前言本标准按照GB/T1.1-20

2、09和GB/T20001.4-2015给出的规则起草。本本标准由吉林省畜牧业管理局提出并归口。本标准起草单位：长春市乾艺生物科技研究所、长春市农业科学院。本标准主要起草人：田来明、赵春梅、张宇、李男、田桂华、申雨弘、崔鹤馨、权心娇、胡桂英、付晓霞、王雨千。本标准仅供内部使用不得翻印I本标准仅供内部使用不得翻印本标准仅供内部使用不得翻印DB22/T2984—2019本标准仅供内部使用不得翻印鹿粘膜病双抗夹心ELISA检测方法警示——使用本标准的人员应有正规实验室工作的实践经验。本标准并未指出所有可能的安全问题

3、。使用者有责任采取适当的安全和健康措施，具体防护措施及要求按照GB19489执行。1范围本标准规定了鹿粘膜病双抗夹心ELISA检测方法的术语和定义、试剂、仪器设备、样品处理、操作步骤和结果判定。本标准适用于鹿粘膜病病毒的检测。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T19489实验室生物安全通用要求本标准仅供内部使用不得翻印3

4、术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1鹿粘膜病mucosaldisease由病毒性腹泻病毒（mucosaldiseasevirus，MDV）引起的鹿传染病，可引起鹿呈多临床表现，主要表现为腹泻、母鹿流产、不孕，产死胎、木乃伊胎或畸形胎等。4试剂除有特殊说明外，所有实验用试剂均为分析纯，实验用水符合GB/T6682中一级水的要求。4.1PBS，见表A.1。4.2包被液，见表A.2。4.3洗涤液，见表A.3。4.4封闭液，见表A.4。4.5pH5.0磷酸盐-柠檬酸缓冲液，见表A.5。4.6底物溶液（OPD

5、-H2O2），见表A.6。4.7终止液，见表A.7。4.8标准阳性，MDVNADL国际标准株用牛肾继代细胞MDBK株培养增值，经反复冻融后制备。4.9标准阴性，pH7.4PBS。4.10MDV免疫球蛋白，见附录B。1DB22/T2984—20194.11MDV酶标抗体，见附录C。5仪器设备本标准仅供内部使用不得翻印5.1离心机，最高转速15000r/min。5.2恒温培养箱，温度均匀度≤±1（37℃时）5.3酶联免疫检测仪，全波长酶标仪。5.4紫外分光光度计，200nm～1000nm。6样品处理6.1样品采

6、集选择新鲜鹿粪3g～5g装入洁净的食品塑料袋内，用封口机封口或结扎紧袋口后立即放入盛有冰块的保温瓶（箱）内。每份样品的包装瓶（袋）上均要贴上标签，写明采集地点，编号，时间等。如暂时不进行检测应－80℃保存。6.2样品处理取1g采集到的鹿粪样品加入10mLPBS（5.1）中充分混匀，3000r/min离心（6.1）30min，上清液即为待检样品。本标准仅供内部使用不得翻印7操作步骤7.1使用前将所有试剂恢复至室温。7.2在ELISA反应板中加入用包被液（5.2）稀释至1.0mg/mLMDV免疫球蛋白（5.10

7、）100μL/孔，37℃（6.2）包被4h。7.3弃去板中溶液，加洗涤液（5.3）300μL/孔，轻微晃动反应板，3min后弃去洗涤液；如此操作3次，最后将ELISA反应板置于吸水纸上轻轻拍干。7.4然后加封闭液（5.4）100μL/孔，37℃封闭1h。7.5重复7.3的操作。7.6加入待检样品100μL/孔，并设阳性对照（5.8）2孔，阴性对照（5.9）2孔，空白对照1孔，密封ELISA反应板，37℃孵育2h。7.7重复7.3的操作。7.8加入酶标抗体（5.11）100μL/孔，密封ELISA反应板，37

8、℃孵育1h。7.9重复7.3的操作。7.10避光环境下，加入底物溶液（5.6）100μL/孔，室温放置25min。7.11加入终止液（5.7）50μL/孔，10min内酶联免疫检测仪（6.3）测定结果。8结果判断8.1波长450nm，先用空白孔校零点，然后读取各孔光密度值。8.2阴性对照平均OD值低于0.05作0.05计算，高于0.05按实际OD值计算。8.3阳性对照OD值≥0.8，实验结果有效。2DB22/T2