实验三-双抗夹心ELISA法检测IL推荐word.doc

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1、.实验三双抗夹心ELISA法检测IL-1白细胞介素-1（IL-1）是一种单核因子，主要由单核细胞-巨噬细胞、上皮细胞以及树突状细胞分泌。它可以促进多种细胞增殖和活化，对免疫应答有重要的调节作用，也被称为淋巴细胞激活因子或内源性热原质等。本实验采用双抗加薪ELISA法检测人血清中的IL-1浓度，将标准品、待测样本加入到预先包被人IL-1单克隆抗体的酶标板中，洗涤除去未结合的成分，再加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的抗人IL-1抗体，它将与人IL-1结合而形成免疫复合物，最后加入底物（OPD）显色，其颜色深浅（450nm波长下测定OD值）与样品

2、中人IL-1浓度呈正相关。【试剂与器材】预包被的酶标板，HRP标记的抗人IL-1抗体、重组IL-1标准品、待检样品、样品稀释液；洗涤液、显色液（含底物及酶反应体系）、终止液；37度恒温水浴锅、酶标仪、微量加样器、一次性吸头、吸水纸等。【方法】1、吸取包被抗体加入凹孔板中，每孔200微升，将凹孔板置于湿盒中，与37度作用1-2个小时候，再置40度冰箱过夜，从冰箱取出凹孔板，帅弃孔中液体，注满洗涤液、甩干，如此重复3次，拍干备用。2、加标准品和待测样本：分别设置标准品孔、待测样本孔和空白对照孔，标准品孔中加入标准品50微升，待测样本孔中加入血清

3、10微升，再加样本稀释液40微升，空白对照孔。。。标准稀释液，加入相应试剂200微升/孔。3、37度中作用45分钟。4、洗板：弃去板内液体，每孔加满洗涤液，静置1分钟，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，重复洗版3次。5、加酶标抗体：每孔加200微升6、37度水浴锅温育20分钟7、洗版：弃去。。。重复3次8、显色：每孔加200微升显色液，37度避光显色15分钟。9、终止：取出酶标板，每孔加终止液500微升10、测定：以空白孔调零，在终止后30分钟内，在450nm波长处测量各孔的吸光值（OD）【结果】以测得的OD值为纵坐标，以标准品浓度为横坐标，绘制标

4、准曲线，根据血清样品的OD值可在标准曲线上查出其浓度，也可以使用各种应用软件来计算。注意：最终浓度为实际测定浓度乘以样品血清的稀释倍数。小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能测定单核吞噬细胞包括血液中的单核细胞和组织器官中的巨噬细胞。单核细胞仅在血液中停留12-24个小时，即进入组织，分化为巨噬细胞。单核/巨噬细胞可做变形运动，对玻璃和塑料有很强黏附力。75%乙醇，Hank’s液（PH7.2），白假丝酵母菌悬液（浓度3x10的七次方个/ml），1%甲紫染液。离心机，恒温水浴箱，显微镜有齿镊，一次性注射器，手术剪，毛细吸管，试管，血细胞计数板.方法2mlH

5、ank’s液，5分钟，离心（10分钟500转）弃上清液，加白假丝酵母菌悬液两滴混匀，37度30分钟每10分钟摇匀一次水溶后再离心（5分钟1000转），其上清液，加入1%甲紫染液2滴，混匀，室温染色5分钟后滴片。