硫酸铵提高裂殖壶菌不饱和脂肪酸积累的代谢组学研究.pdf

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1、第44卷分析化学(FENXIHUAXUE)研究报告第5期2016年5月ChineseJournalofAnalyticalChemistry685～692DOI：10．11895／j．issn．0253-3820．150948硫酸铵提高裂殖壶菌不饱和脂肪酸积累的代谢组学研究陈胜兰赵晓艳任路静纪晓俊黄和(南京工业大学，生物与制药工程学院，南京211816)摘要采用基于气相色谱一质谱(GC—MS)联用技术的代谢组学方法，通过分析裂殖壶菌胞内代谢物的变化，研究(NH)2SO提高裂殖壶菌不饱和脂肪酸积累的作用机制。利用GC—MS技术对添加0，1．5，2．5和3．5L(NH)：

2、SO的发酵样品进行分析，结合K—Means算法对数据进行聚类分析，得到胞内代谢物的热图。主成分分析(PCA)和偏最小二乘判别分析(OPLS—DA)得分图可将不同添加条件下裂殖壶菌胞内物质明显区分。运用PLS—DA载荷图及模型的变量重要性因子(VIP)值，发现了7种代谢物可作为区别4种不同条件下的生物标志物。经NIST和Wiley谱库检索，它们分别为葡萄糖、肌醇、甘露醇、果糖、磷酸、乙醇胺、乙胺。代谢途径分析结果表明，(NH)SO是通过弱化糖酵解途径和乙酸合成支路，提高苹果酸酶的活力，强化氨基酸代谢和NADPH的积累，从而提高不饱和脂肪酸积累。关键词裂殖壶菌；代谢组学；

3、主成分分析；硫酸铵；二十二碳六烯酸1引言代谢组学是对在某一特定生理时期内生物样品中的所有低分子量代谢产物进行无偏定性和定量分析的一门学科，通过检测代谢物水平在某种刺激下所产生的整体变化(量变以及质变)，鉴定出目标差异代谢物_1J，具有分离效率高、灵敏度高、可选择性地分离检测大量代谢物和同分异构体等优点而被广泛关注。二十二碳六烯酸(Docosahexaenoicacid，C22：6，简称DHA)是一种重要的．3长链多不饱和脂肪酸j，是神经细胞生长及维持的重要元素，在预防和治疗心血管疾病、防治动脉硬化等方面具有显著功效5]。而裂殖壶菌具有生长速度快、易培养、细胞内脂肪酸组

4、分简单和DHA含量高等优势，是通过发酵生产DHA的优良菌种。有研究发现，通过补加(NH)SO的方式，可以缓解由氮源消耗所引起的DHA含量降低，最终DHA含量达到44．7％，比未添加(NH)SO时提高34．6％。同时，在未添加(NH)SO时，裂殖壶菌油脂中不皂化物的含量高达264．78mg／g，是正常情况的1．8倍，严重影响了油脂的品质。另外，Ling等_9报道，在DHA发酵中同时补加谷氨酸钠，可使DHA的含量达到24．74g／L，比不添加时提高了65．9％。上述研究仅从宏观上发现了氮源在DHA发酵中的显著作用，但氮源促使多不饱和脂肪酸积累的调控机制尚不清楚。本研究利用

5、基于气相色谱质谱联用(GC—MS)技术的代谢组学方法，分析裂殖壶菌Schizochyriumsp．HX一308在添加不同浓度(NH)SO条件下胞内代谢物的变化特征，寻找其潜在的代谢差异标志物，获得代谢物变化与发酵性能参数的相互关系，探讨(NH)SO促使DHA高效积累的可能机理。2实验部分2．1仪器与试剂TraceGC2000DSQ气相色谱．质谱联用仪(美国Agilent公司)；MD200—1氮气浓缩仪(杭州奥盛公司)；GC-2010气相色谱仪(日本Shimadzu公司)；SBA-40C生物传感分析仪(山东省科学院生物研究所)；3K15高速冷冻离心机(美国Sigma公司

6、)。2015-08-25收稿；2016-01．18接受本研究系国家863计划(No．2014AA021701)，国家自然科学基金(No．21306085)，高等学校博士学科点专项科研基金(No．20133221120008)资助E—mail：renlujing@njtech．edu．cn分析化学第44卷甲醇(HPLC级，山东禹王实业有限公司)；吡啶(色谱纯，上海凌峰化学试剂有限公司)；N一甲基一Ⅳ·(三甲基硅氧烷基)三氟乙酰胺(N-Methyl—N-trimethylsilyltrifluoracetamide，MSTFA)，甲氧胺盐酸盐(上海阿拉丁生化科技股份有限公

7、司)；培养基组成物质(国药集团化学试剂公司)；核糖醇(>199％，Sigma公司)；实验用水为某品牌纯净水。2．2菌种与培养方法裂殖壶菌(Schizochytriumsp．HX一308)CCTCCM209059，由本实验室自主筛选获得，保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)。种子、发酵培养基组分参考文献[10]，发酵培养基初始葡萄糖浓度为60g／L，接种量为10％，过程中第一次补糖时同时添加不同浓度(1．5，2．5和3．5L)(NH)SO，培养条件为30oC，170r／min。2．3发酵表观数据分析葡萄糖浓度和细胞干重的测定见参照文献[11]，苹