溶菌酶基质辅助激光解吸电离-串联飞行时间质谱分析中的不常见修饰及脱水反应.pdf

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1、第41卷分析化学(FENXIHUAXUE)研究报告第4期2013年4月ChineseJournalofAnalyticalChemistry494～499DOI：10．3724／SP．J．1096．2013．20866溶菌酶基质辅助激光解吸电离-串联飞行时间质谱分析中的不常见修饰及脱水反应王勇李水明何曼文(深圳大学生命科学学院，深圳市海洋生物资源与生态环境重点实验室，深圳518060)(深圳大学生命科学学院，深圳市微生物基因工程重点实验室，深圳518060)摘要利用基质辅助激光解吸电离一串联飞行时间质谱(MALDI—TOF／TO

2、F)分析了溶菌酶标准蛋白，在常规搜库条件下鉴定到6个独立肽段，Mascot得分420，鉴定覆盖率为54％。此外，经人工解析发现，肽段IVS—DGDGMNAWVAWR(98--*112)在样品处理过程中发生了天冬酰胺脱氨化、天冬酰胺脱氨化+甲硫氨酸氧化、天冬酰胺脱氨化+甲硫氨酸氧化+色氨酸氧化等修饰，在激光解吸电离过程中发生脱水反应，脱水位点是脱氨后形成的第103位天冬氨酸。此外，还发现了部分肽段的丙酰胺化修饰。本研究表明，选择一级质谱中的极低丰度离子进行串联质谱分析和利用人工解析方法分析数据库未匹配数据，有可能发现一些特殊的蛋白

3、质修饰，可增加数据利用度和分析结果的确定性。关键词溶菌酶；基质辅助激光解吸电离一串联飞行时间质谱；天冬酰胺脱氨化；甲硫氨酸氧化1引言基于质谱的蛋白质组学的快速进展不仅体现在各种技术和分析软件的进步，也反映在其不断地参与解决深层次的生物学问题，例如蛋白质的绝对和相对定量、蛋白质相互作用网络和在整体水平上参与研究各种分子生物学解毒机制中的相关蛋白等“J。尽管如此，蛋白质的鉴定仍是上述研究的基础，生物信息学仍然是组学研究中的瓶颈问题之一’。随着大规模基因组测序技术的出现，越来越多生物的基因组被测序，因此，数据库搜索，即利用串联质谱数据

4、匹配现有的蛋白质数据库并依据结果打分是目前最主要的蛋白质鉴定方式，而从头测序算法则是直接利用串联质谱数据推导肽段和蛋白结构，适用于分析新物种或者基因组未测序生物。数据库检索算法的一个主要问题是蛋白质的翻译后修饰，或者在样品处理过程的化学变化会导致结果不被匹配，尽管可以通过加入翻译后修饰选项提高搜库效果，并且前人也在这方面取得了很大进展，但是一个基本的问题是无论应用何种算法和软件，常规的修饰选项多为半胱氨酸乙酰化(烷基化)，加入额外选项会导致搜索数据库变大，速度减慢，误报增加，因此，翻译后修饰研究的障碍不在于质谱仪不能检测，而在于

5、计算机的识别¨“。有时，生物学研究的对象只是单一蛋白质，需要尽可能地通过质谱数据挖掘出更多信息，这时人工解析有可能提供更多的帮助。本研究以溶菌酶为例说明不常见修饰的质谱检测和人工解析，为相关工作提供借鉴。2实验部分2．1仪器与试剂4800MALDITOF／TOFAnalyzer基质辅助激光解吸电离一串联飞行时间质谱仪(MALDI．TOF／TOF，美国AppliedBiosystems／MDXSCIEX公司)，仪器控制软件为4000SeriesExplorerSoftware；超纯水处理系统(Milli．Q，美国Millipore

6、公司)；pH计(320．S，梅特勒一托利多仪器上海有限公司)；胰蛋白酶(质谱分析级，Promega公司)；O／．腈基4一羟基肉桂酸(美国Sigma公司，使用前重结晶)；乙腈和三氟乙酸等其它试剂均为分析纯或优级纯。蛋白分子量标记物#SM0431(包括溶菌酶等7种标准蛋白质，Thermo2012-08-27收稿；2012-12-09接受本文系国家自然科学基金(No．31070731)和深圳市生物、互联网、新能源产业发展专项(No．cxB2O10052400O8A)资助项目E·mail：wypine@yahoo．com．cn第4期王勇

7、等：溶菌酶基质辅助激光解吸电离一串联飞行时间质谱分析中的不常见修饰及脱水反应495FisherScientific公司)。2．2胶内胰酶水解条件蛋白分子量标记物经一维电泳分离后的目标条带用移液枪枪头切下，放入PCR管后脱色：用100txL高纯水振荡洗涤10rain，重复3次；100tzL25Inmmol／LNH4HCO3室温振荡平衡20min；100IAL25mmol／LNH4HCO3／50％乙腈室温振荡30min；干燥胶粒：100IAL25mmol／LNH4HCO3室温振荡平衡20min；加100tzL100％乙腈于胶粒中静置

8、10min，重复一次；酶解：加入520mg／L质谱用测序级胰蛋白酶，4℃放置30min，使酶液完全浸透胶粒，吸掉多余的酶液；加入5IxL40mmol／LNHHCO3／10％ACN，37oC水浴8h。2．3质谱分析条件基质制备：将6g／LO／-腈基-4一羟基肉桂酸