流式细胞术在免疫学的应用.ppt

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1、FCM在免疫学中的应用一、流式细胞免疫学样品制备的基本原理流式免疫技术是以单细胞或单细胞核为研究对象，并结合传统的免疫学方法，其基本原理是，细胞上的抗原(或细胞膜受体)与相应的单克隆抗体结合，形成带有荧光的抗原抗体复合物，通过流式细胞术测定其特定荧光量二、流式免疫学染色方法免疫样品的制备要求：1.一定数量的单细胞悬液，这是流式测定的基础，如果悬液细胞数量过少，测定结果的准确性可能会受到影响2.死细胞和碎片在某些免疫荧光样品测定中，有可能干扰免疫荧光的分布，应予以排除，以免引起测定结果的假阴性或假阳性免疫样品的制备要求：3.荧光素所发荧光的强度与结合位点多少应成正比，在通常情况下，流式免疫样品

2、的制备采用直接或间接免疫标记法二、流式免疫学染色方法二、流式免疫学染色方法直接免疫荧光标记法：取与荧光素交联的抗体直接加入一定量的细胞(约1×l06细胞/ml)悬液中，进行免疫标记反应。如做双参数标记染色，可把两种分别标有不同荧光素的抗体同时加入二、流式免疫学染色方法直接免疫荧光标记法：二、流式免疫学染色方法直接免疫荧光标记法：2标记反应一定时间后，用PBS液(pH7.2-7.4)洗涤细胞悬液两次，离心后重新悬浮于缓冲液中，上机检测二、流式免疫学染色方法直接免疫荧光标记法：优点：所测结果准确，操作简便，阴阳性结果易分析，适用于同一细胞群体多种参量标记的测定二、流式免疫学染色方法直接免疫荧光标

3、记法：缺点：在检查每一抗原时都要制备与抗原相应的荧光标记抗体，不但荧光抗体制备复杂，而且费用昂贵，另外其敏感性也较间接法稍差二、流式免疫学染色方法间接免疫荧光标记法：取一定量的细胞或细胞核悬液约1x106细胞/ml加入特异的第一抗体，待结合反应一定时间后，洗去多余的抗体，加入荧光标记的第二抗体，形成一种抗原－抗体－抗抗体免疫复合物，通过FCM检测其荧光二、流式免疫学染色方法间接免疫荧光标记法：二、流式免疫学染色方法间接免疫荧光标记法：优点：操作较简单，费用较低，只要制备相关的第一抗体，二抗可较广泛的应用。二、流式免疫学染色方法间接免疫荧光标记法：缺点：由于二抗常为多克隆抗体，非特异性荧光背景

4、较强，非特异性结合较多，影响了实验结果的分析，因此，在样品制备的同时应增设阴阳性对照，避免测定结果的假阳性，另外，由于间接免疫荧光标记步骤较多，增加了细胞的丢失三、免疫荧光测定的标本处理技术混合细胞群体的区分：在制备好的单细胞悬液中，常含有不同大小、形状的细胞群，对于不同的细胞群，常用90°光散射和前向角散射区分其体积大小，然后可以通过计算机画出地形图，等高线图或点阵图，画出不同细胞群的范围，选择有用的细胞群体三、免疫荧光测定的标本处理技术混合细胞群体的区分：三、免疫荧光测定的标本处理技术混合细胞群体的区分：这种区分细胞群体的方法简便。然而，固定剂固定后的细胞可能会改变某些细胞的光散射的特性

5、，在区分细胞群体时应加以考虑。常用的另一种区分细胞的方法是利用某些染料对死活细胞膜的穿透性不同，核着色与否这些特点进行区分三、免疫荧光测定的标本处理技术混合细胞群体的区分：如PI染料染色培养后的细胞，死细胞内有PI染料发出较强的荧光，而活细胞由于膜的选择性通透，阻挡了PI染料进入细胞内，因此所发出的荧光很弱三、免疫荧光测定的标本处理技术免疫荧光染料常用的免疫荧光染料有：异硫氰荧光素(FITC)藻胆蛋白类染料藻红蛋白(PE)藻青蛋白别藻红蛋白德州红(TexasRed)三、免疫荧光测定的标本处理技术免疫荧光染料：这几种染料都能与纯化的单克隆抗体结合，可以在较广范的波长范围内被有效地激发，其发射光

6、容易被区分，分别为红、绿橙色三、免疫荧光测定的标本处理技术免疫荧光染料：用两种染料结合两种不同的抗体，每一种细胞结合抗体的荧光都是不同的，用不同的探测器测定不同的发射波长，这样可以同时检测一个细胞的两个参数三、免疫荧光测定的标本处理技术免疫荧光染料：FITC和PE两种染料都可以在488nm被激发，它们可同时与两种不同的抗体结合，FITC的荧光发射在绿区，大约530nm，而PE的发射在橙红区，大约在570nm以上，它们适用于同时区分不同抗原位点的细胞群三、免疫荧光测定的标本处理技术标本的保存和固定：在实验中，染色后的标本常常不能及时上机检测。在这种情况下，应该把染好的标本进行固定三、免疫荧光测

7、定的标本处理技术标本的保存和固定：FCM免疫方法对固定剂的要求比较严格，固定剂必须有效地固定细胞并保护细胞内抗原或细胞膜表面抗原特性不受破坏，又必须使被固定细胞的细胞膜对抗体有一定的通透性，使其能够进入细胞内与相应抗原结合三、免疫荧光测定的标本处理技术标本的保存和固定：醇类、醛类固定剂易导致所固定的细胞缩小变形，一般常用1-4%的多聚甲醛缓冲液(pH7.4)进行固定，或用0.37-1.5%的甲醛缓冲液(pH7