基于胸腺嘧啶-三聚氰胺-胸腺嘧啶结构和SYBR GreenⅠ荧光检测牛奶中三聚氰胺.pdf

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1、第42卷分析化学(FENXIHUAXUE)研究简报第8期2014年8月ChineseJournalofAnalyticalChemistry1205～120910．11895／j．issn．0253-3820．140190基于胸腺嘧啶．三聚氰胺-胸腺嘧啶结构和SYBRGreenI荧光检测牛奶中三聚氰胺欧丽娟刘宏伟刘开建(湖南工学院材料与化学工程学院，衡阳421002)(湖南大学化学化工学院化学生物传感与计量学国家重点实验室，长沙410082)摘要基于胸腺嘧啶(T)一三聚氰胺一T特异性结构，建立了SYBRGreenI荧光均相检

2、测三聚氰胺的方法。聚氰胺不存在时，SYBRGreenI与聚T单链DNA结合较弱，荧光信号较弱；三聚氰胺存在时，聚T单链DNA通过T．二三聚氰胺一T错配形成折叠结构。SYBRGreenI嵌入双链DNA的双螺旋结构中，释放出强荧光信号。结果表明，三聚氰胺浓度在0．1～10I~mol／L范围内呈良好的线性关系，检出限为35nmol／L。本方法简单、快速、成本低、灵敏度高。关键词T一三聚氰胺一T；SYBRGreenI；荧光检测；三聚氰胺1引言三聚氰胺是一种三嗪类含氮杂环有机化合物，其含氮量高，约为66．6％_1，远高于蛋白质(平均含

3、氮量16％)。现用检测食品中蛋白质含量的方法为凯氏定氮法，它通过检测食品中的含氮量确定蛋白质的含量。因此，食品或饲料中添加三聚氰胺，会使蛋白质含量虚高。同时，三聚氰胺作为一种白色结晶粉末，无味，掺杂后不易被发现，从而使劣质食品和饲料在检测时蒙混过关。三聚氰胺与尿酸结合生成难溶于水的结石j，对人体健康构成威胁，甚至可能引起婴幼儿死亡。因此，准确测定食品及饲料中的三聚氰胺含量具有重要意义。传统的检测三聚氰胺的方法有气相色谱一质谱联用法]、酶联免疫检测法]、高效液相色谱法等。但是这些方法操作复杂，需要高素质的操作人员或者分析时间较

4、长，不能满足日常快速分析的要求。近年发展了一些检测三聚氰胺的新方法，如电化学方法、化学发光法、纳米材料比色法、荧光探针法¨⋯和表面增强拉曼散射技术¨。尽管这些方法检出限低、灵敏度高，但是预处理复杂耗时，需要衍生过程或者昂贵的仪器。最近研究发现，三聚氰胺可以通过分子间氢键介导胸腺嘧啶(T)配对，形成稳定的．r_三聚氰胺一T特异性结构¨n15j。Huang研究小组利用此原理实现了对三聚氰胺的比色检测。聚T链在纳米金表面吸附后，在一定盐离子存在下，通过T一三聚氰胺一T特异性作用，纳米金颗粒团聚，宏观上发生由红色到蓝色的颜色变化。尽

5、管上述方法提高了三聚氰胺检测的灵敏度，且具有较好的特异性，但需要合成纳米金，操作复杂，成本高。SYBRGreenI(SG)是一种双链DNA荧光染料。与单链DNA单独存在时显示非常弱的荧光，与双链DNA结合后，荧光信号大大增强¨”]。本研究利用T与三聚氰胺的特异性结合，设计了一种均相检测三聚氰胺的荧光传感方法。三聚氰胺的存在促使聚T单链DNA改变其构象，形成折叠结构，SYBRGreenI(SG)与双链DNA结合产生强的荧光信号。本方法简单，快速，成本低，灵敏度高，可用于食品中三聚氰胺的现场快速检测。2实验部分2．1仪器与试剂H

6、itachiF-7000荧光分光光度计(日本Hitachi公司)，激发波长480／1111，扫描范围505～580nm，激2014~2-28收稿；2014-044)3接受本文系国家自然科学基金(Nos．21205035)，湖南省自然科学基金(Nos．12JJ4017，13JJ3123)和湖南省重点学科建设项目资助E—mail：oulijuanann@aliyan．tom分析化学第42卷发和发射狭缝宽度均设为5．0nIT!。三聚氰胺(上海百灵威科技有限公司)；SYBRGreenI(SG，10000×，北京鼎国生物技术有限公司)

7、；DNA链(由大连宝生物有限公司合成)；其它试剂均为分析纯；实验用水为超纯水(电阻大于18．3Mn)。2．2三聚氰胺的检测在25反应体系中包含10mmol／L磷酸盐缓冲液(PBS，pH7．4，200mmol／LNaC1)、30nmolfL聚T核酸链，2xSG；加入系列浓度的三聚氰胺，混合均匀后，室温下避光培育30rain后，稀释到100L，放人荧光光谱仪，检测荧光信号强度。3结果与讨论3．1实验原理基于三聚氰胺特异性DNA和SCI荧光定量检测三聚氰胺的原理如图1所示。三聚氰胺不存在时，聚T链为柔性的单链结构，荧光信号很弱。因

8、为sGI是一种双链核酸染料，与单链DNA的结合较弱，游离状态下的SYBRGreen1只能发出微弱的荧光。当三聚氰胺存在时，三聚氰胺能够与胸腺嘧啶(T)通过分子间氢键形成T一三聚氰胺一T的特异性结构(图1B)，使聚T链发生折叠。SGI嵌入双链DNA的双螺旋结构中，在528nlxl处释放出强的