响应面法和变温培养优化海洋黑曲霉产纤维素酶发酵条件.pdf

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1、第32卷第5期2016年10月化学反应工程与工艺ChemicalReactionEngineeringandTechnologyVol32，No50ct．2016文章编号：1001--7631(2016)05__0473—08响应面法和变温培养优化海洋黑曲霉产纤维素酶发酵条件陈作国1，-，郑刚1，蔡勇1，薛栋升2，杨志坚3，姚善泾41．浙江大学舟山海洋研究中心，浙江舟山316021；2．湖北工业大学生物工程学院，湖北武汉430000；3．浙江大学生命科学学院，浙江杭9’I．I310058：4．浙江大学化学工程与

2、生物工程学院，浙江杭州310027摘要：选用响应面法和变温培养相结合的方法，优化了一种海洋黑曲霉生产耐盐性纤维素酶的液体发酵条件。首先通过单因素实验初步确定碳源、氮源、温度、表面活性剂、接种量、装液量以及初始pH；随后选择Plackett．Burman(PB)设计挑选出影响滤纸酶活(FPA)的主要成分：麸皮和吐温．80(Tween．80)；再通过爬坡实验，使麸皮和吐温一80浓度接近最大酶活区域；接着选择响应面分析快速有效地求得该菌株产耐盐性纤维素酶的最佳培养基配方：最后进行了变温培养实验确定适宜的稳定期培养温度

3、。得到的优化发酵条件为：麸皮5．53％(w)，玉米浆O．5％(w)，磷酸二氢钾0．2％(w)，Tween一800．197％(w)，初始pH5．0，接种量8％(m01)，装液量40mL，180r／min，37℃培养2d后继续28℃培养2d。优化后的滤纸酶活为0．566U／mL，与未优化时的酶活(O．283U／mL)相比增加了94．5％。关键词：海洋黑曲霉纤维素酶响应面法优化变温培养中图分类号：Q93文献标识码：A纤维素酶是由外切酶、内切酶和纤维二糖酶等三种酶组成的复合酶，它们通过一种协同作用使纤维素依次降解成纤维

4、二糖和葡萄糖【l，2J。纤维素酶用途极大【3。6J，但普通纤维素酶越来越无法满足工业生产中的一些抗逆性需求，而在海洋独特的环境中，存在着多种耐受极端条件如耐高温、耐高盐、耐极端pH的菌种【7J，这就为解决工业化生产中存在的高盐度、高温、极端pH环境而使纤维素酶活性降低乃至失活等问题提供一条新的思路以及途径。王玢等【8】从黄海泥样中筛选出的海洋细菌所产生的酶的最适反应温度为35℃，明显低于普通纤维素酶的最适反应温度，而且其在10℃左右也含有较高的活性。Trivedi等【9】从海藻中分离出的杆菌所产生的纤维素酶，既

5、能在碱性环境也能在高盐度环境下保持高活性。综上所述，研究耐极端条件的纤维素酶产生菌有着极大的研究和应用价值。刘杰凤等IloJ曾用浙江东海海底淤泥中筛选得到一株海洋黑曲霉，它能分泌一种耐盐性纤维素酶，其在高盐环境下能保持较高的活性，并通过单因素实验简单优化了此菌株的液体发酵条件，阐明了此纤维素酶的酶学性质及其耐盐性。Xue等[1l】利用响应面法优化了一种以水葫芦为主要碳源的环保型固体培养基。何可可等[12,13]也报道了他们在研究海洋纤维素酶方面的研究进展。为了耐盐性纤维素酶的工业化放大生产和应用，本实验希望以这

6、株海洋黑曲霉为菌株，在单因素实验的基础上，选用响应面分析，并与一种新颖的变温培养方法相结合，系统且有效地优化该菌株生产耐盐性纤维素酶的液体发酵条件，以期为该酶的工业化生产和应用提供必要的实验数据与参数。收稿日期：2015—07．08；修订日期：2015．10．09。作者简介：陈作国(199卜一)，男，硕士研究生；姚善泾(1957一)，男，教授，通讯联系人。E-mail：yaosj@zju．edu．cn。基金项目：国家自然科学基金项目(21376214)；浙江省公益技术研究社会发展项目(2015c33219)：舟

7、山市科技计划项目(2014C51022)。474化学反应工程与工艺2016年10月1实验材料与方法1．1培养基与主要试剂斜面培养基：马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基。未优化的液体产酶培养基(50mL)：麸皮30g／L，氯化铵5班，磷酸二氢钾2班，pH为7。麸皮主要成分(每100g)：水分14．5g，蛋白质15．8g，碳水化合物61．4g，纤维31．3g，钙206mg，磷682mg，钾682mg，钠12．2mg，镁382mg，铁9．9mg，锌5．98mg，锰10．85mg。玉米浆主要成分：干物质50％，水分50％

8、，蛋白质45％，总糖2．21％，铁0．01％，磷1．6％，钙0．04％，钾2．2％。1．2发酵菌株本实验的菌株是从浙江东海海底淤泥中筛选得到的海洋黑曲霉(Aspergillusniger)，菌种保藏于中国典型培养物保藏中心，地址为中国，武汉，武汉大学，保藏号为CCTCCNO：M2010132。1．3实验方法1．3．1菌种发酵产酶培养方法将海洋黑曲霉接种到斜面PDA培养基，在28℃条件下