代谢组学方法研究奶牛注射氯霉素后牛奶中的生物标志物.pdf

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1、第38卷分析化学(FENXIHUAXUE)研究简报第8期2010年8月ChineseJournalofAnalyticalChemistry1199～1202D0I：10．3724／SP．J．1096．2010．01199代谢组学方法研究奶牛注射氯霉素后牛奶中的生物标志物王世成李国琛王颜红胡小燕张红(中国科学院沈阳应用生态研究所，沈阳110016)摘要建立了高效液相色谱一质谱(HPLC—MS)技术研究牛奶代谢组学的方法。样品用乙腈提取，经浓缩富集，采用HPLC．MS技术研究了注射氯霉素后牛奶中内源性代谢物随时间的变化情况。结果表

2、明，注射氯霉素后，牛奶的代谢指纹图谱中8个谱峰的变化随给药及休药时间呈现一定升降规律；采用偏最小二乘判别分析法(PLS—DA)可将给药组与空白组样品完全分开；鉴定了对组间差异贡献较大的化合物为单羟基十八碳二烯酸(HODE)，HODE可以作为注射氯霉素后奶牛体内代谢应激产生的内源性生物标志物。关键词牛奶；氯霉素；代谢组学；生物标志物；单羟基十八碳二烯酸1引言代谢组学是测定生物体受病理生理刺激和基因修饰所产生的与时间相关的多元代谢产物的一门新学科¨。通过分析生物体液和组织中内源性代谢物，代谢组学可以寻找代谢物变化与整体生物学状况的关

3、系及生物标志物，已广泛应用于药物毒性和机理J、疾病诊断和动物模型等研究。代调组学以液相色谱一质谱(LC—MS)、气相色谱一质谱(GC—Ms)J、核磁共振谱(NMR)E9]等方法为主要研究手段。其中LC—MS以其广泛适用性、优良分离性能和较高灵敏度已被广泛应用于复杂体系中的靶标分析。Ninonuevo等¨应用高效液相色谱一质谱(HPLC．MS)和基质辅助激光解吸电离傅立叶变换离子回旋共振质谱(MALDI—FTICRMS)技术分析了人乳中低聚糖组成。Fong等】采用蛋白质组学技术研究了牛奶乳清蛋白的组成变化。应用代谢组学技术研究外源

4、物质对牛奶主要成分，如蛋白质、碳水化合物、脂类等成分变化影响鲜有报道。氯霉素是对革兰氏阳性、阴性细菌均有抑制作用的广谱抗生素。由于氯霉素对生物体有很大的毒副作用，作为兽用药可能对畜禽产品的食用安全产生影响。本研究以注射氯霉素后奶牛所产牛奶为研究对象，利用代谢组学技术，高效分离和鉴定了在氯霉素影响下牛奶差异成分，筛选出氯霉素对牛奶影响的内源性生物标志物。本研究结果有助于阐明抗生素对畜禽类产品的食用安全影响机理。2实验部分2．1仪器与试剂2695液相色谱仪(Waters公司)，QuattroPremierXE质谱仪及Masslynx

5、V4．1软件(Waters公司)；LTQ—OrbitrapXLhybrid高分辨质谱仪(ThermoFisher公司)。13(S)．羟基一9，11一十八碳二烯酸(13一HODE，美国Cayman公司)；氯霉素(纯度>99％，中国药品生物制品检定所)；注射氯霉素(0．25g／2mL，批号0801141，郑州羚锐制药有限公司)。2．2实验材料和样品制备选取健康成年奶牛10头，随机分成两组：空白组5头，给药组5头，实验期问正常喂料。给药组每日按体重注射氯霉素25mg／kg，连续用药5d，休药5d，从给药前日至休药期结束，每日收集给药组

6、和空白组牛奶1L，一70℃冷冻保存，供代谢组分析。2．3样品处理冷冻的牛奶在室温下融化，取50mL，加50mL乙腈沉淀蛋白，加2～3gNaC1，振摇，静置分层。取2009—12—15收稿；2010-04-07接受本文系中科院知识创新重要方向项目(No．KSCX2-Yw—N4935)和沈阳市科技计划项目(No．2007GX-49)资助E—mailwangyh@iae．ac．cn1200分析化学第38卷出有机相，加NaC1至饱和并重新分层，3000g离心，再取有机相，加正己烷脱脂3次，每次20mL，弃去正己烷层，乙腈层旋蒸(<40℃

7、)至近干后用氮气吹干。用1mL乙腈溶解，离心，过0．45Ixm滤膜，待测。2．4色谱质谱条件XBridgeC18色谱柱(150mm×3．0mm，5m)；流速0．3mL／min；柱温3O℃。流动相A为乙腈，B为水(含0．1％乙酸)。梯度洗脱程序：0～30min，60％～80％A；30～40min，80％～95％A：40～45min，95％A。进样体积20。ESI负电离模式扫描，毛细管电压2．0kV，锥孑L电压40V，离子源温度120oC，锥孔气流速100L／h，去溶剂气流速300L／h，去溶剂气温度300℃。喷雾电压3．5kV；透

8、镜电压100V；毛细管温度275oC；毛细管电压36V；鞘流气体流速8arb。3结果与讨论3．1空白组和给药组牛奶代谢指纹图谱的变化规律给药5d后，5头奶牛的牛奶图谱均与空白组和051015202530354045t／min停药组相比存在显著的差异。通过观察总离