植物组织培养实验之具体配置.ppt

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1、植物组织培养实验实验一培养基贮备液（母液）的配制目的与要求：熟悉MS培养基的组成，掌握贮备液的配制方法.实验步骤：称量分别溶解混合定容。一，MS培养基的组成1、大量成分→贮备液Img/LNH4NO31650KNO31900CaCl22H2O440MgSO47H2O370KH2PO4170配制20倍浓度贮备液500mL.2、微量成分→贮备液IImg/LKI0.83H3BO36.2MnSO44H2O22.3ZnSO47H2O8.6Na2MoO42H2O0.25CuSO45H2O0.025CoCl26H2O0.025配制100倍浓度

2、贮备液100mL.3、铁→贮备液IIImg/LFeSO47H2O27.8Na2EDTA2H2O37.34、有机成分→贮备液IVmg/L肌醇100烟酸0.5盐酸硫胺素(VB1)0.1盐酸吡哆醇0.5甘氨酸2配制100倍浓度贮备液100mL.配制100倍浓度贮备液100mL.二，常用生长调节剂6-BA：1mg/mL(溶于少量1N盐酸后以蒸馏水定容）。NAA:1mg/mL（先用少量95%乙醇溶解后以蒸馏水定容）。三、作业：（一）一般可将MS培养基分为哪四个部分？分别含有几种试剂？各种试剂的浓度（mg/L）如何？（二）如需配制MS培养

3、基的20×的贮备液I量为500mL、100×的贮备液II、III和IV各100mL以及BA和NAA（浓度为1mg/mL）各50mL，则应分别称取多少量的各种试剂？注意要点有哪些？贮备液I(g)贮备液III(mg)MgSO47H2O3.70500mLFeSO47H2O278100mLNH4NO316.50Na2EDTA2H2O373CaCl22H2O4.40生长调节剂KNO319.006-BA50mg50mLKH2PO41.70NAA50mg50mL贮备液II(mg)贮备液IV(mg)KI8.3100mL肌醇1000100mLH

4、3BO362烟酸5MnSO44H2O223盐酸硫胺素1ZnSO47H2O86盐酸吡哆醇5Na2MoO42H2O2.5甘氨酸20CuSO45H2O0.25称量溶解混合定容CoCl26H2O0.25实验二固体培养基的配制与灭菌一、实验目的：学习、掌握植物组织固体培养基的配制和灭菌方法。二、实验步骤：称量混合调pH值灭菌称量：按每瓶培养基终体积50mL计，称取适量的琼脂（常用量8g/L）和蔗糖（常用量30g/L），置于大烧杯中，加蒸馏水至需配培养基终体积的3/4左右，（加热）使之溶解。混合：分别加入一定量的贮备液I、II、III、I

5、V和生长调节物质及其它特殊补加物，再加蒸馏水直至需配培养基的终体积。调pH值：充分混合后，在60℃水浴条件下用0.1mol/L的NaOH和0.1mol/L的HCl调节培养基的pH值至5.8。灭菌：封严培养容器口后，120℃灭菌20min后，将培养基取出，置于水平台子上，在室温下冷却，备用。实验三外植体材料的预处理、消毒及接种一、实验目的：熟悉外植体材料的预处理，掌握其消毒和接种方法。二、方法步骤：（一）对采来的植物材料进行适当的预处理。除去不需要的部分，将所需部分切割至适当大小，置自来水龙头下流水冲洗几分钟至几小时，主要视植

6、物材料清洁程度而定。这在污染严重时特别有用。（二）用洗衣粉水（1~2角匙洗衣粉/100ml水）等浸洗上述植物材料约5min，再用自来水冲净洗衣粉水。这是进一步减少污染的处理。同时配制消毒液：50%次氯酸钠溶液。（三）将接种用具、无菌水等从80℃烘箱中或直接从高压灭菌器中取出，置于超净工作台上。打开超净工作台中的紫外灯，在进行紫外线灭菌处理至少30min后关掉紫外灯。（四）操作人员洗手擦干，换上洁净工作服，戴上帽子以免头发散落以及带来污染。坐到超净台前，并将装有经湿热灭菌培养基的培养瓶、配好的消毒液、洗净沥干的植物材料置于超净工

7、作台上，用70%酒精棉球擦手与器具外壁，即可对经上述预处理的植物材料进行表面灭菌处理，自此以后各步均须在超净工作台上操作。（五）具体首先将经上述预处理、沥干水的植物材料放入广口瓶或烧杯，向其中倒入新鲜配制、浓度一定并且加有一定量（通常为灭菌剂消毒液的0.5%，或每100mL消毒液滴加10~15滴）Tween-80（土温-80）等表面活性剂的消毒液适量（液面高度超出植物材料至少0.5cm），开始计算灭菌时间。也可在使用上述灭菌剂之前，先将植物材料浸于70%乙醇灭菌10~30秒。（六）在持续灭菌时间内定时用玻璃棒轻轻搅动，以促进植

8、物材料各部分与消毒液充分接触，驱除气泡，使灭菌彻底。在灭菌时间结束前1min时，即可开始用玻璃棒等轻轻压住植物材料将消毒液慢慢倒入废物缸，注意勿使植物材料滑出。接着立即倒入适量无菌水，轻搅植物材料以清洗去除灭菌剂残留。一般表面灭菌时间的计算是从倒入消毒液开始，到倒入无菌水为止