资源描述：
《定量PCR技术综述.doc》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在工程资料-天天文库。
1、实时定量PCR技术综述基本原理1.PCR反应动力学右图为PCR反应曲线（横坐标为循环数，纵坐标表征产物量），不同的Illi线代表初始模板量不同的PCR反应。PCR反应的动力学公式为：G=G（1+E）n其屮C°和G分别为初始模板和n循环的拷贝数，n为循环数，E为扩增效率（0WEW1）,理想状态下（即每个循环屮所有模板均与引物结合并等到扩增），E为1。由上图可知，只有在线性区段E值才为定值，这样才能通过检测G定量C。，由于终点检测不能保证在线性区段，所以重复性不好，实时检测（毎个循环检测一次）技术解决了这个问题。2.定量PC
2、R原理定最PCR是将待测标木与一系列浓度（Co）已知的标准品在同一条件下共同扩增，并进行实时检测，根据标准品的检测值及己知的C。值作出标准
3、11
4、线，如右图（横作标为的C。对数值），再根据待测标木的检测值衣标准曲线上杏到待测标本的C。值。3.信号产生forncl目前定量PCR技术信号产生都是基于FRET（fluorescenceresonanceenergytransfer）的原理，即在一定波长的光激发下，一个荧光基团A发光，并且被邻近的另一个荧光基团B吸收，使荧光基团B发光。如检测荧光基团A,丿勺在FRET消除后；如检
5、测B,则应在FRET发生时检测。根据信号产生方式的不同可将定量PCR技术分为三类：TaqManProbes技术；HybridizationProbes技术；MolecularBeacons技术。TaqManProbes技术（右图A）是PerkinElmer公司1995年研制，利用热稳定DNA聚合酶5’一3’外切酶活性，将TaqMan探许5’端荧光基团切去，使Z与歹端荧光基团分离、荧光淬灭消失，在特定波长下检测5,端荧光基团即可表征PCR产物的量。HybridizationProbes技术（右图B）是Roche公司建立的，
6、PCR反丿应退火过稈屮，两个探针与模板杂交（相邻一个碱基），发生FRET,这时检测第二ExonucleaseProbeFormatPnmer丨ExonucleaseProbePnmerHybridizationProbeFormatPnmerDonorPrcceptorProbePnmer©FAMc®TAMRA(f^Fluorescein:LC)LightCyclerRed640HybridMolecularBescooFluorophoreQuencher个荧光基团即可表征PCR产物的量。HybridizationPr
7、obes技术要求热稳定DNA聚合酶不具备5,->3?外切酶活性，而是在引物延伸过程屮被取代，使探针可在下一-循环再与模板杂交，如探针被降解，可导致定量不准。MolecularBeacons技术（上图C）利用茎环结构的探针，当形成茎环结构时，发生荧光淬灭，退火过程屮，探针与模板杂交，荧光淬灭消失，在特定波长下检测5,端荧光基团即可表征PCR产物的量。二.荧光标记1.TaqManProbesTaqMan探针通常在5'端以荧光基团FAM标记，靠近3,端以荧光基团TAMRA标记，3'端磷酸化以防止探针在PCR扩增过程屮被延伸。下
8、表列出了两种荧光基团的吸收及发射波长。FAMTAMRA吸收波长492547发射波长5185732.HybridizationProbesHybridization探针技术中,上游clonorProbe3'端以荧光基团Fluorescein标记；下游acceptorProbe5'端以Roche的LC-Red640标记（当用双荧光基团时还可同时使用LC-Red705）,3端磷酸化以防止探针在PCR扩增过程屮被延伸。也有文献报道acceptorProbe5,端以Cy5标记，下表列出了各种荧光基团的吸收及发射波长。Fluores
9、ceinLC-Red610LC-Red705Cy5吸收波长494625685643发射波长5196407056673.荧光标记基团与PCR仪的激发与检测波长rh于荧光标记基团的选择还受到定最pcr仪所提供的激发和检测波长的制约，所以这里介绍一下临床应用屮主流机型所提供的检测波长，见下表。GeneAmp5700SDSAB1Prism7700（适用于科硏）LightCycler检测波长530nm500-660nm530nm;640nm;705nm三.TaqManProbes技术要点TaqManProbes技术要求所用的热稳定
10、DNA聚合酶不但要具有5'->3'外切酶活性,而且要求所获得的扩增曲线符合PCR反应动力学。■2Ota!———■—....MatthewJ.Longley等（1990）研究了热稳定DNA聚合酶的5'->3'外切酶活性,认为：（1）其5'-*3?外切酶活性和DNA聚合酶活性位于同一肽段；（2）5,外切酶活性依赖于双链D
