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1、实时定量PCR技术综述基本原理1.PCR反应动力学右图为PCR反应曲线(横坐标为循环数,纵坐标表征产物量),不同的Illi线代表初始模板量不同的PCR反应。PCR反应的动力学公式为:G=G(1+E)n其屮C°和G分别为初始模板和n循环的拷贝数,n为循环数,E为扩增效率(0WEW1),理想状态下(即每个循环屮所有模板均与引物结合并等到扩增),E为1。由上图可知,只有在线性区段E值才为定值,这样才能通过检测G定量C。,由于终点检测不能保证在线性区段,所以重复性不好,实时检测(毎个循环检测一次)技术解决了这个问题。2.定量PC
2、R原理定最PCR是将待测标木与一系列浓度(Co)已知的标准品在同一条件下共同扩增,并进行实时检测,根据标准品的检测值及己知的C。值作出标准
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4、线,如右图(横作标为的C。对数值),再根据待测标木的检测值衣标准曲线上杏到待测标本的C。值。3.信号产生forncl目前定量PCR技术信号产生都是基于FRET(fluorescenceresonanceenergytransfer)的原理,即在一定波长的光激发下,一个荧光基团A发光,并且被邻近的另一个荧光基团B吸收,使荧光基团B发光。如检测荧光基团A,丿勺在FRET消除后;如检
5、测B,则应在FRET发生时检测。根据信号产生方式的不同可将定量PCR技术分为三类:TaqManProbes技术;HybridizationProbes技术;MolecularBeacons技术。TaqManProbes技术(右图A)是PerkinElmer公司1995年研制,利用热稳定DNA聚合酶5’一3’外切酶活性,将TaqMan探许5’端荧光基团切去,使Z与歹端荧光基团分离、荧光淬灭消失,在特定波长下检测5,端荧光基团即可表征PCR产物的量。HybridizationProbes技术(右图B)是Roche公司建立的,
6、PCR反丿应退火过稈屮,两个探针与模板杂交(相邻一个碱基),发生FRET,这时检测第二ExonucleaseProbeFormatPnmer丨ExonucleaseProbePnmerHybridizationProbeFormatPnmerDonorPrcceptorProbePnmer©FAMc®TAMRA(f^Fluorescein:LC)LightCyclerRed640HybridMolecularBescooFluorophoreQuencher个荧光基团即可表征PCR产物的量。HybridizationPr
7、obes技术要求热稳定DNA聚合酶不具备5,->3?外切酶活性,而是在引物延伸过程屮被取代,使探针可在下一-循环再与模板杂交,如探针被降解,可导致定量不准。MolecularBeacons技术(上图C)利用茎环结构的探针,当形成茎环结构时,发生荧光淬灭,退火过程屮,探针与模板杂交,荧光淬灭消失,在特定波长下检测5,端荧光基团即可表征PCR产物的量。二.荧光标记1.TaqManProbesTaqMan探针通常在5'端以荧光基团FAM标记,靠近3,端以荧光基团TAMRA标记,3'端磷酸化以防止探针在PCR扩增过程屮被延伸。下
8、表列出了两种荧光基团的吸收及发射波长。FAMTAMRA吸收波长492547发射波长5185732.HybridizationProbesHybridization探针技术中,上游clonorProbe3'端以荧光基团Fluorescein标记;下游acceptorProbe5'端以Roche的LC-Red640标记(当用双荧光基团时还可同时使用LC-Red705),3端磷酸化以防止探针在PCR扩增过程屮被延伸。也有文献报道acceptorProbe5,端以Cy5标记,下表列出了各种荧光基团的吸收及发射波长。Fluores
9、ceinLC-Red610LC-Red705Cy5吸收波长494625685643发射波长5196407056673.荧光标记基团与PCR仪的激发与检测波长rh于荧光标记基团的选择还受到定最pcr仪所提供的激发和检测波长的制约,所以这里介绍一下临床应用屮主流机型所提供的检测波长,见下表。GeneAmp5700SDSAB1Prism7700(适用于科硏)LightCycler检测波长530nm500-660nm530nm;640nm;705nm三.TaqManProbes技术要点TaqManProbes技术要求所用的热稳定
10、DNA聚合酶不但要具有5'->3'外切酶活性,而且要求所获得的扩增曲线符合PCR反应动力学。■2Ota!———■—....MatthewJ.Longley等(1990)研究了热稳定DNA聚合酶的5'->3'外切酶活性,认为:(1)其5'-*3?外切酶活性和DNA聚合酶活性位于同一肽段;(2)5,外切酶活性依赖于双链D