实时定量pcr技术综述.doc

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1、3.000-泄量PCR是将待测标木与一系列浓度（Co）U知的标准品在同一条件下共同扩增，并讲行实时检测，根据标准品的检测值及已知的Co值作出标准曲线，如右Tarnoln实时定量PCR技术综述一.基本原理1.PCR反应动力学右图为PCR反应曲线（横坐标为循环数，纵坐标表征产物最），不同的曲线代表初始模板最不同的PCR反应。PCR反丿、'、/「的动力学公式为：Cn=C0（1+E）n其屮Co和5分别为初始模板和门循环的拷贝数，n为循环数，E为扩增效率（0WEG）,理想状态下（即毎个循环屮所有模板均与引物结合并等到扩增），E为仁2500■2000-«1.50

2、0・1.000-0.500-0000-•0500・0123456789由上图可知，只有在线性区段E值才为定值，这样才能通过检测Cn定量Co,由于终点检测不能保证在线性区段，所以重复性不好，实时检测（每个循环检测一次）技术解决了这个问题。2.定量PCR原理图（横作标为的Co对数值），再根据待测标木的检测值在标准1111线上杏到待测标木的Co值。1.信号产生目前足量PCR技术信弓产生祁是基于FRET（fluorescenceresonanceenergytransfer）的原理，即在一定波长的光激发下，一个荧光基团A发光，并口被邻近的另一个荧光基团B吸收

3、，使荧光基团B发光。如检测荧光基团A,丿应在FRET消除示；如检测B,则应•在FRET发生时检测。根据信号产生方式的不同可将定量PCR技术分为三类：TaqManProbes技术;HybridizationProbes技术；MolecularBeacons技术。TaqManProbesa技术（右图A）是ExonucleaseProbeFormatPnmer©ExonucleaseProbePerkinElmer公罚Pnmer1995年研制，利用B热稳沱DNA聚合HybridizationProbeFormatPnmerDonorProbe酶55->3?

4、外切酶活Pnmef性，将TaqMan探®FAM针5’端荧光基团切°去，使Z与3'端荧光基团分离、荧光淬灭消失，在特定波长下检测5'端荧光基团即可表征®TAMRAsffL）FluoresceinLightCyclerRed640FluorophorrMolecahrBeaconHybridQueocbcrPCR产物的量。HybridizationProbes技术（右图B）是Roche公司建立的，PCR反应退火过稈屮，两个探针与模板杂交（相邻一个碱基），发生FRET,这时检测第二个荧光基团即可表征PCR产物的量。HybridizationProbes技术

5、要求热稳定DNA聚合酶不具备5J3'外切酶活性，而是在引物延伸过程屮被取代，使探针可在下一循环再与模板杂交，如探针被降解，可导致定量不准。MolecularBeacons技术（上图C）利用萃环结构的探针，当形成茎环结构时，发生荧光淬灭，退火过程屮，探针与模板杂交，荧光淬灭消失，在特定波长下检测5,端荧光基团即可表征PCR产物的量。二•荧光标记I.TaqManProbesTaqMan探针通常在5'端以荧光基团FAM标记，靠近3’端以荧光基团TAMRA标记，3,端磷酸化以防止探针在PCR扩增过程中被延伸。下表列出了两种荧光基团的吸收及发射波长。FAMTA

6、MRA吸收波长492547发射波长5185732.HybridizationProbesHybridization探针技术中，上游donorProbe3'端以荧光基团Fluorescein标记；下游acceptorProbe5'端以Roche的LC-Red640标记（当用双荧光基团时还可同时使用LC-Red705）,3’端磷酸化以防止探针在PCR扩增过程屮被延伸。也有文献报道acceptorProbe5'端以Cy5标记，下表列出了各种荧光基团的吸收及发射波长。FluoresceinLC-Red640LC-Red705Cy5吸收波长4946256856

7、43发射波长5196407056673.荧光标记基团与PCR仪的激发与检测波长由于荧光标记基团的选择还受到定量PCR仪所提供的激发和检测波长的制约，所以这里介绍一下临床应用屮主流机型所提供的检测波长，见下表。GeneAmp5700SDSABIPrisni7700（适用于科研）LightCycler检测波长530nm500-660nm530nm;640nm;705nm%1.TaqManProbes技术要点TaqManProbes技术要求所用的热稳泄DNA聚合酶不但要具有5J3,外切酶活性，而且要求所获得的扩增曲线符合PCR反应动力学。MatthewJ.

8、Longley等（1990）研究了热稳定DNA聚合酶的5J3'外切酶活性,认为:（1）其5J3'外切酶活性和