实时定量pcr技术原理

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1、实时定量PCR技术原理陈云地8008100192，021-64736366-407chenyd@appliedbiosystems.com1提要基本概念定量PCR的数学原理定量PCR的化学原理等位基因鉴定原理定量PCR仪光学原理2基本概念什么是PCR链式反应的雪崩效5'3'5'3'5'3'5'forwardprimer5'5'3'5'reverseprimer5'3'5'3'5'3'5'5'3'5'3'5'3'5'5'3'5'5'3'5'5'3'3'5'3'5'3'5'5'5'3'5'5'3'5'3'5'3'5'5'3'5'

2、3'5'3'3'5'5'3'5'4？·PCR能否只用一条引物？三条引物？·PCR能否使用ddNTP？5典型的PCR四阶段平台期线性增长期指数增长期基线期6PCR理论方程N=N0x(1+e)nN:N0:e：n:产物分子数起始分子数扩增效率循环次数平台期PCR方程只在指数期成立线性期lg[DNA]7指数期y=x(1+e)n循环次数起点定量与终点定量起点量是样本中原来的DNA量，更有意义；终点量经过PCR放大，并非研究所期望的数据起点定量误差小，终点定量误差大终点定量同一个样品重复96次起点定量8标准曲线方法CT20-19-18-17-16-·

3、·⊗·C⊗··B·⊗··A15-··IIIIIIAbsoluteamount.(copies)3,1256,25012,50025,00050,000100,000←EXACTscale通过CT值测定起始DNA量CTAbsoluteamount9SampleASampleBSampleC16181950,000copies12,500copies6,250copies定量PCR的数学原理什么是CT值荧光信号有统计学意义显著增长(即穿过阈值线)时的循环次数从基线到指数增长的拐点所对应的循环次数11线性图谱CT值

4、半对数图谱CT值？·浓度增加1倍，CT值减小1个单位·浓度增加10倍，CT值减小3.3个单位12为什么CT∝起始DNA浓度?Rn=RB+X0(1+E)nRs当循环次数n=CT值时：RT=RB+X0(1+E)CTRslg(RT-RB)=lgX0+CTlg(1+E)+lgRsCTlg(1+E)=-lgX0+lg(RT-RB)–lgRsCT=−logXOlog(1+EX)+log(RT−RB)−logRSlog(1+EX)13即CT=-klgX0+b（线性方程）CT值与起始DNA浓度的关系CT值lg起始DNA浓度CT=-klgX0+b？·单

5、拷贝检测在理论和实验上能做到吗？·最理想的标准曲线斜率是多少？15什么是阈值基线信号的标准偏差x10基线范围标准偏阈值差16基线阈值CT值基线调整规则如果CT值>18，不需调整，使用自动分析结果如果CT值<18，修改终点，再分析一次起点：进口试剂取3，国产试剂取6终点：最小的CT值–4，通常为15长度：大于或等于6个循环阈17基线CT值值PCR方程只在指数期成立CT值和阈值必须位于指数增长阶段内平台期线性增长期Log[DNA]指数增长期y=x(1+e)n循环数18手工数据分析方法1.实验结束，软件根据默认值的基线(3-15)自动分析，给

6、出结果和图谱2.如果CT值>18，使用自动分析结果，出报告3.如果有CT值<18，根据[最小的CT值-4]修改基线终点，重新分析数据19软件自动的数据分析方法软件自动计算全部参数：基线、阈值、CT值、浓度20？·能否用鼠标拖阈值线以正确区分阴性与阳性？·阈值与DNA浓度成反比，对吗？21定量PCR的化学原理两种定量化学·染料染色–SYBR®GreenI–溴乙锭(EthidiumBromide)·探针标记23–––––TaqManTMTaqManMGBDual-oligoFRETpairs分子信标(Molecularbeacons)Scorpion

7、sTM/AmplifluorTM1、TaqMan探针5'3'5'5'RQ3'3'5'3'5'24TaqMan探针定量原理5'forwardprimerRprobeQ3'3'5'5'3'1.聚合reverseprimer5'5'3'Q3'5'5'3'5'2.链取代RQ5'3'3'5'5'3'RQ5'3.Taq酶的5’→3’外切活性R=报告基团ReporterQ=淬灭基团Quencher255'3'5'3'4.聚合完成5'3'5'共振能量转移荧光共振能量转移(FRET)当某个荧光基团的发射谱与另一个荧光基

8、团的吸收光谱重叠，且两个基团距离足够近时，能量可以从短波长（高能量）的荧光基团传递到长波长（低能量）的荧光基