实时定量pcr技术原理及应用

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1、聚合酶链式反应技术及其应用提纲第一节聚合酶链式反应扩增原理第二节PCR反应体系和循环参数的优化第三节PCR反应的问题与对策第四节一个常规PCR实验的设计第五节聚合酶链式反应技术类型第六节聚合酶链式反应技术应用第七节实时荧光定量PCR技术的原理及应用聚合酶链反应(PolymeraseChainReaction,PCR)聚合酶链反应(polymerasechainreaction，PCR)是近十几年来发展和普及最迅速的分子生物学新技术之一。由于它具有强大的扩增能力，并且可与其他分子生物学方法(如核酸杂交)和免疫学方法(如ELISA)相结合应用，使其敏感性和特异性都大大增强，因而广泛

2、地应用于生物医学领域的各个学科，包括基因的克隆、修饰、改建、构建cDNA文库，遗传病，传染病的诊断，法医学鉴定，物种起源，生物进化分析，流行病学调查，等等。由于PCR对世界生物医学研究的巨大推动作用，其发明者Mullis因而获得1992年诺贝尔医学奖。最早报道的PCR是用大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ经枯草杆菌蛋白酶处理后获得的Klenow片段来催化DNA链的延伸。由于加热变性时酶会失活，需要补加一份酶催化下一轮合成。这样不仅操作复杂,而且由于酶反应的温度较低，DNA分子会产生二级结构或引物非特异退火，使反应效率低且易出现非特异性产物，同时，会增加污染的机会。耐热DNA聚合酶的应用使P

3、CR得以完善。这种酶在加热95℃时不会变性，引物退火和链的延伸可以在较高的温度下进行，因而使得PCR的产率和特异性都大大提高。PCR技术问世后，不仅迅速在生物医学领域得到广泛应用，而且不断衍生出许多新的技术，使其应用范围不断扩大，特异性和敏感性也不断提高。比如反转录PCR(RT-PCR)是以mRNA为模板，通过反转录反应合成cDNA，再做PCR扩增，因而可检测特异的mRNA或得到其cDNA克隆；如果仅有很少的序列资料，可通过锚式PCR对RNA进行分析；差异显示PCR（DD-PCR）可以鉴定和分离在不同条件下(如机体或细胞受某种刺激或疾病时)某些有表达差异的基因，而无需确切的序列

4、资料；免疫PCR是将PCR的强大扩增效力应用于免疫学检测中，与传统方法相比其灵敏性要提高几个数量级；PCR-ELISA则是将PCR与核酸杂交、ELISA连为一体，用ELISA鉴定PCR产物，避免了因使用SouthernBlotting所带来的放射性污染等等。第一节聚合酶链式反应扩增原理PCR是利用耐热DNA聚合酶在体外条件下，催化一对引物间的特异DNA片段合成的基因体外扩增技术。它包括三个基本过程：第一步加热变性靶序列靶序列模板DNA经94℃左右加热一定时间后，双链DNA解离成为单链。第二步引物与靶序列退火靶序列靶序列Primer1Primer2BiotinBiotin5’3’

5、5’5’3’5’3’3’模板DNA经加热变性成单链后，把温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合。第三步引物延伸靶序列靶序列Primer1Primer2BiotinBiotin5’3’5’5’3’5’3’3’TaqDNAPolymeraseDNA模板-引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以靶序列为模板，dNTP为反应原料，按碱基配对原则，合成一条新的与模板DNA链互补的单链。第1个PCR循环完成后得到两个拷贝的靶序列靶序列靶序列30次循环后靶序列扩增的数量No.ofNo.AmpliconCyclesCopiesofTarget12243841653266

6、4201,048,576301,073,741,8241cycle=2Amplicon2cycle=4Amplicon3cycle=8Amplicon4cycle=16Amplicon5cycle=32Amplicon6cycle=64Amplicon7cycle=128AmpliconDNA扩增量呈指数上升反应最终的DNA扩增量可用Y＝(1＋X)n计算。Y代表DNA片段扩增后的拷贝数，X表示每次扩增效率的平均值，n代表循环次数。平均扩增效率的理论值为100%，但在实际反应中平均效率达不到理论值。反应初期，靶序列DNA片段的增加呈指数形式，随着PCR产物的逐渐积累，被扩增的DN

7、A片段不再呈指数增加，而进入线性增长期或静止期，即出现“停滞效应”，这种效应称平台期。PCR产物合成过程指数期平台期第二节PCR反应体系和循环参数的优化（一）PCR反应体系1、引物2、耐热TaqDNA聚合酶3、三磷酸脱氧核苷酸（dNTP）4、镁离子5、模板6、缓冲液（二）循环参数1、变性的时间和温度2、引物退火的温度与时间3、延伸时间和温度4、平台效应（一）PCR反应体系1、引物2、耐热DNA聚合酶3、脱氧核苷三磷酸4、镁离子5、模板6、PCR缓冲液7、ddH2OMg2+Mn2+dCTPdG