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《人体外周血淋巴细胞染色体制备与观察实验方案 (1).doc》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在工程资料-天天文库。
1、人体外周血淋巴细胞染色体制备与观察实验方案⑴人体外周血淋巴细胞培养及染色体组型分析实验方案2012级师范2班第3组组员：吴婵胡颖月央珍杨基伟杨青松宋海燕田金梅（组长）一、实验目的常握人体外周血淋巴细胞培养与染色体组型分析的方法。二、实验原理人的1ml外周血约含冇1X10*6^3X10*6个小淋巴细胞，它们几乎都处于G0或G2期，一般情况下不分裂，但但釆用人工离体培养的方法，经PHA（植物血球凝集素）刺激后，能转变成可分裂的淋巴母细胞进行冇丝分裂。所谓外周血培养即是将外周血接种在适当的培养物中加入适量的秋水仙素，使纺锤体微管解聚，这样细胞停留在中期，可以获得大量的
2、分裂细胞。用低渗盐溶液（一般是0.075mol/L的KCI）处理，使其屮的红细胞及分裂相细胞膜和一部分细胞质除去然后用Carnoy固定液固定，最后以气干法制片，可获得较好的染色体标本。核型（karyotype）指一个细胞屮的整套染色体，按英大小、形态特征顺序排列所构成的图像。通常是将显微摄影得到的染色体照片剪贴而成。在完全正常的情况下，一个体细胞的核型一般可代表该个体的核型。组型（idio卽am）是以模式图的方式表示，它是通过许多细胞染色体的测量取其平均值绘制成的，是理想的，模式化的染色体组成，代表一物种染色体组型的特征。将待测细胞的核型进行染色体数目、形态特性
3、的分析，确定其是否与正常核型完全一致，称为核型分析（karyotypeanalysis）。这对于探索人类遗传病的发病机理，探讨动物和植物的起源，以及物种间的亲缘关系等都具有重要意义。染色体的特征以有丝分裂中期最为显著，所以一般都分析中期分裂相。根据染色体着丝粒位置可将染色体分为屮部着丝粒染色体（m），亚屮部着丝粒染色体（sm）,亚端部着丝力粒染色体（st）,端部着丝力粒染色体（t）。对于任何一个的基本形态特征来说，重要的参数有以下3个：（1）相对长度二单条染色体的长度/（单倍体常染色体+X或Y染色体）的总长度X100%（2）臂指数二长臂/短臂（反映着丝粒位置的指
4、数）（3）着丝粒指数二短臂/整个染色体长度X100%（反映着丝粒位置的指数）人类体细胞的正常核型是含有23对染色体，共46条。其中22对是男女共冇的染色体，一对为男女所不同的性染色体，男XY,女XX。根据丹佛（I960）,伦敦（1963）和芝加哥（1966）会议提出的标准，即按照染色体长度依次减小和着丝粒位置以及其他特征，把人类体细胞染色体分为七个组群，各自特征简括于表三、实验材料和试剂2、材料人的静脉外周血（组内选取男女生各一名，取血样）2、试剂完全RPMI-I640培养液（含双抗，小牛血清），肝素溶液（医院采血时已加）,PHA（植物血球凝集素）溶液母液10m
5、g/mL,75%乙醇湫水仙素溶液母液50ug/mL,Giemsa染液,0.075mol/LKCI溶液,Carnoy固定液,磷酸缓冲液PH6.8；纯酒精，冰乙酸等3、器材恒温培养箱,离心机，分析天平,显微镜，超净工作台，移液枪，离心管（8个），培养瓶（4个），试管架，量桶（10ml,2个），烧杯（50ml和25ml各一个），酒精灯,染缸，胶头滴管（7个），玻璃棒（2根），载玻片（8片）等。四、实验方法和步骤（-）各种试剂及培养基的配制⑴完全RPMI-1640培养基的配制（老师己配好）：称取RPMI-I640培养粉9.8g溶于l,000mL蒸憾水中，经G6型号细菌过
6、滤漏斗中0.22um的滤抽滤后,加入小牛血清ImL,肝素3滴（0.03ml）,双抗5滴（0.05ml）,NaHC03调pH至7.2〜7.4,备用。（2）PHA（植物血球凝集素）溶液：老师提供10mg/ml的母液⑶肝素溶液：医院釆血时己加（4）秋水仙素溶液：老师提供50ug/ml的母液（5）低渗液的配制：称取0.2795gKCI溶于50mL双蒸憎水屮，配制成溶液浓度为0.075mol/L的低渗液50ml□（6）固定液的配制：9ml纯酒精+3ml冰乙酸。（7）Giemsa（吉姆斯）染液（全班统一配制）Giemsa原液:Giemsa粉剂0.8g,甘油50ml,甲醇50
7、ml配制方法：先少量甘汕加入研钵中，将Giemsa粉剂在研钵中充分研磨（40min）,再倒入剩余甘油，并在56°C温箱中保温2h,然后加入甲醇，混合摇匀，用有色玻璃瓶密封保存备用。Giemsa稀释液：临用时，取Giemsa原液1份加9份磷酸缓冲液（老师提供0.2mol/l的母液，用时稀释一倍）稀释。（二）实验操作步骤实验前准备：器具消毒灭菌药品配制Giemsa:l份原液，9份PH为7.4的磷酸缓冲液卡诺氏固定液：甲醇：冰醋酸=3:1（24h内使用）培养基添加0.0795ml浓度为10mg/ml的PHA母液载玻片冰冻处理超近工作台消毒灭菌操作人员消毒实验过程：1•
8、培养基配制将4个洁净的培
