外周血淋巴细胞染色体制备影响因素探讨

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1、外周血淋巴细胞染色体制备影响因素探讨摘要：目的通过对不同培养时间及秋水仙素处理条件、滴片高度等进行比较，建立木室较成熟的外周血淋巴细胞染色体制备技术。方法随机选择5例待测外周血淋巴细胞染色体患者作为实验对象，采集肝素抗凝静脉全血2nd,各接种4瓶，其中培养时间分别为62h、70h,秋水仙索处理条件为lh（终浓度0.2?滋g/ml）、3h（终浓度0.08?滋g/ml）,滴片高度为2cm、10cm和30cm。计算不同处理条件下的细胞分裂指数，并对结果进行统计分析。结果培养62h和70h均可获得较多分裂相，两者比较差异无

2、统计学意义（P〉0・05）；秋水仙素处理3h（终浓度0.08?滋g/ml）的分裂相比处理lh（终浓度0.2?滋g/ml）明显增多（P〈0・05）；3种滴片高度均可获得染色体分散良好的分裂相。结论外周血淋巴细胞经过62〜70h培养及0.08?滋g/ml秋水仙素处理3h后，可获得良好的染色体分裂相，滴片高度对染色体的分散无影响。关键词：淋巴细胞；培养；秋水仙素；染色体为减少出生缺陷、提高人口素质，我国目前已经广泛开展染色体分析技术，其屮外周血淋巴细胞染色体核型分析是产前诊断的重要组成部分，同时也是研究染色体与临床疾病关

3、系的重耍手段。由于本实验操作过程比较繁琐，影响因素很多，各地方的染色体制备效果也略有不同。故为提高本院细胞遗传室染色体的分析效率和结果的准确性，通过对外周血淋巴细胞染色体制备过程中的几个关键环节进行探讨，以建立适合本实验室的较为成熟的染色体制备方法。1资料与方法1.1一般资料2013年11月在川北医学院附属医院门诊就诊拟行外周血染色体检测的患者5例，釆集肝素抗凝静脉全血2ml备用。1.2仪器与试剂恒温培养箱，恒温水浴锅，离心机，恒温干燥箱，Leica光学显微镜；RPMI1640培养基和秋水仙素（40?滋g/ml）（

4、均购自广州拜迪生物技术有限责任公司），胰酶（日本Sigma）,0.075mol/L氯化钾低渗溶液，新鲜配制的固定液（甲醇：冰醋酸二3：1）,磷酸盐缓冲液（PH7.4）,吉姆萨染液（购自湖南湘雅基因技术有限公司）。1.3方法1.3.1培养时间吸取250?滋1静脉全血加入5ml培养基中，分别于当天10点和18点各接种2瓶（至加秋水仙素时的培养时间分别为70h和62h）o1.3.2秋水仙素处理将2个时间点接种的细胞分为两组，一组以终浓度为0.2?g/ml的秋水仙素作用lh,另一组处理3h（终浓度为0.08?g/ml）o1

5、.3.3滴片高度滴片时将处理好的淋巴细胞悬液分别以2cm、10cm和30cm高度各滴冰玻片2张（每张1滴）。1.4染色体制备其余步骤参照《现代临床分子与细胞遗传学技术》[1]进行。以细胞计数板对细胞悬液进行计数，调整细胞数为105〜106/L后滴冰玻片。1.5细胞分裂指数计算：以低倍镜（10X）分别观察每张玻片上细胞滴的左上、左下、右上、右下和中间5个视野，计数细胞总数和分裂期细胞总数，按以下公式计算细胞分裂指数。细胞分裂指数二分裂期细胞总数/总细胞数X100%1.6计量资料以均数标准差表示，运用统计软件SPSS1

6、6.0的t检验对结果进行统计分析，以P<0.05表示差异有统计学意义。2结果2.1培养时间同一标本经培养62h和72h后再用秋水仙素进行处理，均可获得足够的分裂相，统计结果显示培养时间比较差异无显著性(P>0.05)o见表1。注：*P>0・052・2秋水仙索处理结果经不同浓度和不同时间的秋水仙素作用后，均获得较多分裂相，其中终浓度为0.08?滋g/ml处理3h组的分裂相比终浓度为0.2?g/ml处理lh组明显增多,差异冇显著性(P<0.05)o见表2。注：*P<0.051.3滴片高度油镜观察不同高度滴片后染色体的分

7、散程度，2cm.10cm和30cm滴片上的染色体均分散良好。见图1。2cm高度10cm高度30cm高度图1不同滴片高度对染色体分散的影响3讨论随着生命科学和医学科学的发展，人们的优生优育意识增强，尤其我国计划生育政策的实施使得人民在少生的同时更渴望得到健康生殖[2],家族中的遗传病史是否对其后代有影响？不良生育史夫妇是否能生育一个健康的宝宝？反复自然流产是否由染色体异常引起的呢？诸多的问题困扰着患者，同时也等待我们去探讨解决。外周血淋巴细胞染色体分析虽然不能将所有的遗传问题解决，但却不失为解疑答惑的冇力工具。外周血

8、淋巴细胞染色体制备包括细胞培养、细胞同步化、细胞低渗、细胞固定、细胞老化和显带等步骤，本次针对细胞培养时间、秋水仙素处理条件和滴片高度等几个环节进行探讨。参照其它实验室或教科书的经验，外周血淋巴细胞培养的时间一般为68〜70h,故木实验室将待测染色体分析的外周血采集严格限定在上午10点〜12点，假如当天下午的申请单只能延续到下一个采集日进行，不仅影响临床工作