【精品】人体外周血淋巴细胞染色体制备与观察报告09级四班二组

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1、外周血淋巴细胞培养及染色体标本制备,染色体组型分析报告生命科学学院09级四班二组组长：傅盛晟其他组员：范方超，曹熙在，陈良婷，母进，刘玉梅，刘天娥提要:探讨一种一般实验室能够开展的方便稳定的染色体制作方法。方法用1640培养基在37°C恒温培养箱屮无菌培养人体外周血淋巴细胞72h,在细胞进行到分裂高峰的中期加入秋水仙索终止液，经过低渗、固定、玻片处理、滴片、核型分析等一系列过程，制作岀染色体标本。结果制作出较多优良的分裂相及清晰可辨的染色体。本法在一般实验室条件下即可制作出人体外周血染色体。关键词：淋巴细胞，培养，染色体，核型分析一.实

2、验目的1、了解动物细胞培养的方法。2、掌握人体外周血淋巴细胞培养与染色休标本制备。3、熟悉人类染色体的镜下检查和核型分析方法。二实验原理所谓外周血培养即是将外周血接种在适当的培养物中加入适量的秋水仙素，使纺锤体微管解聚，这样细胞停留在中期，对以获得大量的分裂细胞。用低渗盐溶液（一般是0.075mol/L的KC1）处理，使其中的红细胞及分裂相细胞膜和一部分细胞质除去，故后以气干法制片，可获得较好的染色体装片。人类外周血细胞木来是终末分化细胞，一般没有分裂能力，但经PHA（植物血球凝集素）或ConA等药物刺激后，转变成可分裂的转化细胞。止常

3、人类染色体的数目为46条（23对）,1960年的Denver会议和1963年的London会议制定了统-•的人类染色体命名体制：按照染色体的相对长度、臂比和着丝粒指数，将常染色体（22对）按大小用阿拉伯数字标记，顺次排列为1〜22号，性染色体用X和Y标记；并按染色体大小和着丝粒位置，把人类染色体分为七个组，用大写字母A〜G表示。染色体经显带处理后，每条染色体都显示出其特定的带纹特征（见下表）。根据这些特征，对以准确地识别每条染色体，检出染色体数忖或结构畸变。表1人染色体组型及其特征组别染色体序号形态，人小着丝点位置次缢痕随体AP3最大中

4、部着丝粒（1,3）亚中部着丝粒（2）1号染色体B4~5次人亚中部着丝粒C6~12X中等亚中部着丝粒9号染色体D13~15中等近端着丝粒有E16~18小中部着丝粒亚中部着丝粒16号染色体F19~20次小中部着丝粒G2广22Y最小近端着丝粒有实验试剂与器材培养基：RPMT1640,按照说明书配制后抽滤、分装，冻存备用。小牛血清：市售，冰冻保存，用时在56°C水浴条件灭活。秋水仙素：已有，lug/ml,（终浓度应为0.5〜l.Oug/ml）根据需要量取!低渗溶液：0.075mol/L氯化钾固定液：甲醇：冰乙酸（3：1）Giemsa染液：磷酸缓

5、冲液（pl【6.8）与Giemsa原液（9：1）1000ml器材：光学显微镜1台，离心机1台，恒温水浴箱1台，恒温箱1台，离心管8支，量简2个，烧杯2只，培养瓶2个，载玻片8张，玻片架2台，枪头2支，移液枪2支，胶塞2个，标签纸1圈，碘酒和酒精棉球，酒精灯1台，天平1台，普通冰箱1台，立式染缸1个、染色架1个、锻子1个，直头小吸管6支、橡皮吸头6个、吸水纸若干，香柏油,擦镜纸，剪子1个，胶水。正常人类染色体G带核型图，核型报告纸四、实验方法（一）培养液配制（在超静工作台内无菌操作）；每个培养瓶（容积30ml）中加入5ml培养液，其中含：

6、RPMI1640（已添加小牛血清）5mlPHA200um1（浓度10mg/ml）依次将上述试剂加入培养瓶中，反复吹打使其混合均匀。（二）采血与培养：到医院采血2ml常规消毒后，将灭菌小瓶送入超净工作台，在火焰旁将血液滴入2个盛有5ml培养液的培养瓶内（男女各一个），每瓶400uml,盖上橡皮塞，轻轻摇动以混匀。贴好标签，将培养瓶放在37°C恒温箱内静置培养72h。（每天摇动培养瓶两次）（三）秋水仙素处理：向经恒温培养终于培养询6小时的外周血淋巴细胞培养液中加入秋水仙素30umlo（四）标本的制备：1、终止培养后，将培养物混匀，倒人离心管

7、内，离心沉淀8分钟（lOOOr/min）,弃去上清液。2、先加入1ml加入低渗液，轻轻吹打，使细胞重悬，然后在加入37°C预温的低渗液6ml,轻轻打匀，置37°C水浴箱中20分钟。（使口细胞膨胀，染色体分散、红细胞解体。）3、低渗处理完毕后，直接加入新配的固定液Iml进行预固定，混匀后，离心8分钟（1000r/min）o4、弃去上清液，沿离心管壁缓慢加入固定液6ml,轻轻吹打混匀，置宗温20分钟。5、离心沉淀1000r/niin,8分钟。6、弃去上情液，再加入固定液6ml吹打均匀重悬细胞，固定8分钟。7、离心沉淀1000r/min,8分

8、钟。8、重复固定一次。9、尽暈吸净上清液，视管底剩下的细胞多少加入适量固定液（（）.3〜0.6ml）,轻轻吹打成细胞悬液。10、滴片：取保存在冰水中的冷湿载玻片张，稍倾斜，用滴管吸取细胞悬液，从30〜40c