HCMV基因在小鼠胚胎成纤维细胞中的表达及病毒感染对细胞自噬的影响.pdf

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1、摘要目的：1．检测人巨绌胞病毒(humancytomegalovirus，HCMV)基因在人胚胎成纤维细胞(Humanembryofibroblast，HEF)署I]小鼠胚胎成纤维细胞(mouseembryofibroblast，MEF)中的表达情况，为进一步研究HCMV种属特异性的机制奠定分子生物学基础。2．观察HCMV感染对HEF和MEF细胞自噬的影响，为HCMV种属特异性的研究寻找新的方向和证据。方法：1．组织块分离培养法结合胶原酶消化法分离原代HEF和MEF细胞。2．在HEF细胞中扩增HCMVADl69毒株，空斑定量法测定病毒滴度。3．相差显微镜下观察病毒感染(MOI

2、=5)后HEF和MEF细胞的形态学改变。4．胙PCR、Western—blot、免疫荧光法检测HCMV-IE、UL84、UL83的表达。5．MTT比色法检测HEF和MEF细胞的增殖活性。6．单丹磺酰戊二胺(monodansylcadaverine，MDC)染色法和透射电镜检测胞内自噬体。7．Western．blot检测自噬相关蛋白Beclinl和LC3的表达：免疫荧光法检测LC3的表达。结果：1．成功分离培养并纯化原代HEF和MEF细胞，传代后细胞状态良好。2．用HCMV分别感染HEF和MEF绌胞后，HEF细胞第2d逐渐变大变圆并相互融合，第4d超过80％细胞可见典型的HCM

3、V特征性病变效应(CPE)，而MEF细胞在相应时问未出现上述的变化。3．RT-PCR和Western．blot表明HEF细胞表达HCMV-IEl、IE2、UL84和UL83mRNA以及其编码的蛋白，相对表达量显著高于正常对照组(P

4、性持续升高(P

5、HEF细胞在感染24h后逐渐降低，但1奇于正常对照组(P<0．01)：而MEF细胞24hBeclinl和LC3．II／LC3．1的相对表达量逐渐升高，显著高于HEF组(P<0．05)。免疫荧光检测LC3蛋白结果与Western．blot结果一致。结论：1。HCMV在MEF细胞中的复制停滞在IE2基因表达之后和UL84基因表达之前的时相，不能产生完整的子代病毒颗粒。推断即刻早期蛋白在MEF细胞内的低水平表达可能与HCMV的种属特异性相关。2．HCMV感染早期诱导HEF和MEF绌胞发生自噬，但感染后期HEF绌胞的自噬效应被抑制，而MEF细胞的自噬并不被明显抑制。3．HCMV感染导

6、致HEF和MEF细胞的不同自噬效应可能与病毒编码蛋白1E之后的蛋白表达相关。硕士研究生杨瑞(病原生物学)指导教师王斌教授关键词：人巨细胞病毒；人胚胎成纤维细胞；小鼠胚胎成纤维细胞；自噬，即刻早期基因课题来源：网家自然科学基金(81070501)山尔省“病原生物学”泰山学者工程资助项口ExpressionofHCMVgenesinmouseprimaryembryoniccellsandtheeffectsofHCMVinfectiononcells’autophagyAbstractObjective：1．Todetecttheexpressionofhumancytomeg

7、alovirusgenesandproteinsininfectedhumanembryofibroblast(HEF)andmouseprimaryembryofibroblast(MEF)cellsforthefurtherresearchofHCMVspecies—specificitymechanisms．2．ToinvestigatethedifferenteffectsofHCMVonautophagyinMEFandHEFcells．Methods：1．HEFandMEFprimaryce