黄芩素抑制人巨细胞病毒感染星形胶质细胞的实验研究.pdf

《黄芩素抑制人巨细胞病毒感染星形胶质细胞的实验研究.pdf》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在应用文档-天天文库。

1、摘要目的：1．观察黄芩素(baicalein，BAD抑制HCMV体外感染人星形胶质细胞引起的IE、pp65mRNA及蛋白表达的变化2．探讨黄芩素抗HCMV感染的机制方法：1．差速贴壁法纯化人原代星形胶质细胞：免疫荧光法标记星形胶质细胞的标志蛋白一胶质纤维酸性蛋白(glialfibrillaryacidicprotein，GFAP)，荧光显微镜下观察并计算细胞纯度。2．在人胚肺成纤维细胞中扩增HCMVADl69株病毒，采用空斑定量法测定病毒滴度。3．Real—TimePCR和免疫荧光检测IE、pp65mRNA及蛋白的表达，确定

2、HCMV是否能在人原代星形胶质细胞中建立感染模型。4．MTT法检测BAI组、HCMV组、HCMV+BAI组和对照组细胞的细胞活性，观察BAI对HCMV感染致人星形胶质细胞增殖异常的抑制作用。5．Real—T恤ePCR检测不同组间(BAI+HCMv组，HCMV组)星形胶质细胞中m及pp65mRNA的变化。6．免疫荧光和Westernblot检测检测不同组问(B舢+HCMV组，HCMV组)星形胶质细胞中IE、UL84、pp65及乙酰化组蛋白H3K9的变化。结果：1．分离纯化培养得到的人原代星形胶质细胞，经免疫荧光染色后于倒置显微

3、镜下观察到细胞有较强的特异性红色荧光，GFAP阳性率大于90％。2．HCMV感染人胚肺成纤维细胞5d左右，超过80％细胞出现典型细胞病变效应(CPE)，呈典型的巨细胞病毒感染后的细胞形态学改变。空斑测定结果显示病毒空斑形成单位为1x108pfu／ml。3．Real—TimePCR和westernblot结果显示HCMV感染组星形胶质细胞可检测到HCMV-IE和pp65的表达，而未感染组细胞则检测不到。4．MTT结果显示，20pMBAI+HCMV组的吸光值在24h、48h、72h均高于HCⅣ【v组(P<0．05)。5．形态学观

4、察病毒感染48h时，HCMV组细胞出现明显的细胞病变效应(CPE)，而20uMBAI+HCMV组细胞状态较好，CPE不明显。6．Real—timePCR结果显示在感染48h和72h时20pMBAI+HCMV组IE、pp65的mRNA表达明显低于HCMV组(P

5、CMV感染所致的星形胶质细胞增殖异常。3．一定浓度的黄芩素能降低HCMV-IE及pp65在细胞中的mRNA和蛋白表达量。4．黄芩素抗HCMV的机制可能是通过抑制了IE2的乙酰化而发挥作用的。硕士研究生周雯(细胞生物学)指导教师于向民教授李玲副教授关键词：人巨细胞病毒；黄芩素；人原代星形胶质细胞课题来源：国家自然科学基金(81070501)ExperimentalStudyofBaicaleinInhibitsHumanCytomegalovirousInfectioninHumanAstrocyteAbstractObjec

6、tive：1．ToinvestigatetheinhibitoryeffectsofbaicaleinonabnormalchangesofIEandpp65mRNAandproteinexpressioncausedbyHCMVinastrocyte(AS)．2．ToexploretheactionmechanismofChineseMedicinebaicaleininhibithumancytomegalovirous(HCMV)infectioninastrocyte．Methods：1．Primaryhumanas

7、trocyteswereextractedbyanchoragevelocity—dependentseparationmethod．Immunofluorescencetechniquewereusedtocalculatethepurityofhumanprimaryastrocytesbyanalyzetheexpressionoftheastrocytesmarkerprotein·GFAP．2．HCMVwaspropagatedinhumanembryolungcells．Theemptyspotfilamento

8、usexperimentwaschosentodetectthedegreeofvirusdrops．3．TheimmediateearlyfIE)andlate(pp65)mRNAandproteinofHCMVweredetectedbyReal—timePCRandimmunoflu