微生物限度检验标准操作规程要点.doc

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1、文件编码:DK/CD-SOP-QC-004-03第19页共19页1　目的规范微生物限度检验操作，确保检验结果准确、可靠。2　依据《中国药典》2010版。3　范围本标准适用于微生物限度检验。4　责任中心化验室负责人：对本规程的实施负责。中心化验室检验人员：严格按照本规程执行检验操作。5　程序5.1　执行标准：《中国药典》2010版。5.2　抽样：照《取样标准操作规程》进行。6细菌、霉菌及酵母菌计数计数方法包括平皿法和薄膜过滤法。检查时，按已验证的计数方法进行供试品的细菌、霉菌及酵母菌菌数的测定。6.1设备、仪器及用具6.1.1设备微生

2、物限度检测室室、净化工作台、生化培养箱（30-350C）、生化培养箱（23-280C）、电热恒温水浴锅、烘箱、电冰箱、灭菌柜、紫外灯等。6.1.2仪器及器皿显微镜、托盘天平、锥形瓶、研钵、培养皿、量筒、试管及塞、吸管、薄膜过滤器等。6.1.3用具大、小橡皮乳头，洁净工作服、口罩、医用手套、接种环、酒精灯、酒精棉球、灭菌剪刀、灭菌镊子、不锈钢药匙、试管架、火柴、记号笔、薄膜过滤膜等。6.2试液6.2.1消毒液A．0.1%新洁尔灭溶液：供手消毒、擦拭操作台面用。文件编码:DK/CD-SOP-QC-004-03第19页共19页B．75%乙

3、醇溶液6.2.2稀释液、试剂及配制A．PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液：取磷酸二氢钾3.56g、磷酸氢二钠7.23g、氯化钠4.3g、蛋白胨1.0g，加纯化水1000ml，微温溶解，滤清，分装，1210C灭菌15分钟。B．聚山梨酯80C．吐温80D．单硬脂酸甘油酯6.3培养基营养琼脂培养基、玫瑰红钠琼脂培养基6.4操作方法6.4.1试验前准备6.4.1.1将供试品及所有已灭菌的平皿、锥形瓶、试管、吸管（1ml、10ml）、量筒、稀释剂等移至传递窗内。每次试验所用物品必须事先计划，准备足够用量，避免操作中出入操作间。6.4.1.2开

4、启微生物检测室紫外灯和空调净化系统，并使其工作不低于30min。6.4.1.3操作人员进入一更，用洗手液或肥皂洗手，烘干。进入二更，用0.1%新洁尔灭溶液洗手，穿戴洁净无菌服、口罩、手套。6.4.1.4操作前先用乙醇棉球擦手，再用乙醇棉球擦拭供试品瓶、盒、袋等的开口处周围，待干后用灭菌的手术镊或剪将供试品启封。6.4.2供试液的制备供试液的制备若需用水浴加温时，温度不宜超过450C，时间不得超过30分钟。除另有规定外，常用的供试液制备方法如下：6.4.2.1液体供试品取供试品10ml，加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml

5、，混匀，作为1:10的供试液。油剂可加入适量的无菌聚山梨酯80使供试品分散均匀。水溶性液体制剂也可用混合的供试品原液作为供试液。6.4.2.2固体、半固体或粘稠性供试品取供试品10g，加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，用适宜的方法，混匀，作为1:10的供试液。必要时加入适量的无菌聚山梨酯80文件编码:DK/CD-SOP-QC-004-03第19页共19页，并置水浴中适当加温使供试品分散均匀。6.4.2.3乳膏剂取供试品5g（或5ml），加至含溶化的（温度不超过45℃）的吐温80、3g单硬脂酸甘油酯、10g聚山梨酯80

6、无菌混合物的烧杯中，用无菌玻璃棒搅拌成团后，慢慢加入45℃的PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，边加边搅拌，使供试品充分乳化，作为1:20供试液。6.4.2.4栓剂取供试品10g，加适量稀释液，置45℃水浴保温10分钟，使溶，加入无菌聚山梨酯805-8ml，振摇使之乳化，再加稀释液（稀释液和聚山梨酯80的总量为100ml），摇匀，作为1:10的供试液。6.4.2.5肠溶制剂取供试品10g，加PH6.8无菌磷酸盐缓冲液至100ml，45℃水浴中，振摇，使溶解，作为1:10的供试液。6.4.3供试液的稀释取1支1ml灭菌吸管

7、吸取1:10均匀供试液1ml，加入装有9mlPH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液的试管中混匀，即为1:100供试液。（此时操作一般为：左手执试管并将塞打开、倾斜，右手执10ml吸管吸量，注意：勿在乙醇灯焰峰正上方操作，以免灯焰将供试液中菌细胞杀灭）以此类推，根据供试品污染程度，可稀释至1:1000、1:10000等适宜稀释级。每递增1稀释剂，必须另换一支吸管。稀释时，吸管插入第1级稀释液内不低于液面2.5cm，反复吸吹约10次。吸液时，应先吸至高于吸管上部刻度少许，然后提起吸管，贴于试管内壁调整液量至刻度，吸管移至第2级稀释管的内壁近

8、液面处（勿接触液面）缓慢地放出全部供试液（吸管内应无黏附或残留液体）。6.4.4检查法6.4.4.1平皿法6.4.4.1.1在进行10倍递增稀释的同时，以该稀释级吸管，吸取每级稀释级供试液各1ml置每个灭菌平皿中，每一稀释级每种培养基