第十五章核酸的研究方法

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1、第十五章  核酸的研究方法一、核酸的分离、提纯和定量测定二、核酸的超速离心三、核酸的凝胶电泳四、核酸的核苷酸序列测定五、DNA聚合酶链反应（PCR）六、DNA的化学合成楚雄师范学院化学与生命科学系范树国6/16/2021台州学院生命科学与医药化工学院柯世省一、核酸的分离、纯化和定量测定尽可能保持其天然状态，防止降解和变性。条件温和，防止过酸、过碱、剧烈搅拌。抑制核酸酶。（一）DNA分离真核DNA以核蛋白（DNP）形式存在，DNP溶于水或高盐溶液（1mol/LNaCl），但不溶于低盐溶液（0.14mol/L

2、NaCl），据此，采用高盐提取，低盐沉淀，可将DNP与RNA核蛋白分开，提取出DNP。楚雄师范学院化学与生命科学系范树国6/16/2021台州学院生命科学与医药化工学院柯世省DNP可用水饱和的酚抽提，去除蛋白质。还可用氯仿异戊醇去除蛋白质。水相中的DNA可被0.3MNaAC-70%乙醇沉淀。（二）RNA的分离RNase的灭活：玻璃器皿：140-200℃，8h塑料器皿：0.1%DEPC，37，过夜提取液加盐酸胍或异硫氰酸胍反应体系中加RNasin等特异的RNase抑制剂楚雄师范学院化学与生命科学系范树国6/

3、16/2021台州学院生命科学与医药化工学院柯世省★用0.14mol/LNaCl使DNP沉淀，上清中即为RNA核蛋白（RNP）。盐酸胍、苯酚等去蛋白。★异硫氰酸胍/苯酚/氯仿法★异硫氰酸胍/氯化铯密度梯度离心法蛋白质：＜1.33g/mlDNA：1.71g/ml左右RNA：＞1.89g/ml★mRNA的制备：oligo(dT)纤维素（琼脂糖凝胶）亲合层析法楚雄师范学院化学与生命科学系范树国6/16/2021台州学院生命科学与医药化工学院柯世省（三）核酸含量的测定方法核酸纯度的鉴定可通过测定样品在260nm和

4、280nm的光吸收比值，进一步的鉴定可通过琼脂糖凝胶电泳或聚丙烯酰胺凝胶电泳。①磷的测定RNA中含磷量为9.0％，DNA中含磷量为9.2％，因此每测得1g磷就相当于含有11g核酸。含磷量的测定是用浓硫酸将核酸消化，使其有机磷变成无机磷，然后与钼酸铵定磷试剂作用，生成蓝色的钼蓝。在一定浓度范围内，蓝色的深浅和磷含量成正比，可在660nm比色测定。从磷的标准曲线可知样品中磷的含量，从而求出核酸的含量。楚雄师范学院化学与生命科学系范树国6/16/2021台州学院生命科学与医药化工学院柯世省②核糖和脱氧核糖的测定

5、RNA中核糖的测定用苔黑酚（3，5-二羟甲苯）法，利用RNA与浓盐酸和3，5-二羟甲苯作用生成绿色物质，在670nm比色测得光吸收值。再从标准曲线中查得对应的RNA的含量。DNA中脱氧核糖的测定用二苯胺法，利用DNA在酸性条件下（冰醋酸和少量浓硫酸）与二苯胺作用生成蓝色化合物，在595nm比色测得光吸收值。再从标准曲线中查得对应的DNA的含量。楚雄师范学院化学与生命科学系范树国6/16/2021台州学院生命科学与医药化工学院柯世省③紫外吸收的测定实验室中最常用的是首先测定样品在260nm和280nm的光吸

6、收值（A值），从A260／A280的比值可判断样品的纯度。纯DNA的A260/A280应为1.8，纯RNA应为2.0。样品中如含有杂蛋白及苯酚，A260/A280比值即明显降低。不纯的样品不能用紫外吸收法作定量测定。对于纯的样品，只要读出260mm的A值即可算出含量。通常以1A值相当于50μg/mL双螺旋DNA或40μg/mL单链DNA（或RNA）或20μg/mL寡核苷酸计算。这个方法既快速，又准确，而且不会浪费样品。楚雄师范学院化学与生命科学系范树国6/16/2021台州学院生命科学与医药化工学院柯世省

7、二、核酸的超速离心不同构象的核酸（线形、环形、超螺旋），密度和沉降速率不同，用CsCl密度梯度离心可以将不同构象DNA、RNA与蛋白质区分开来这一方法常用于质粒DNA的纯化。楚雄师范学院化学与生命科学系范树国6/16/2021台州学院生命科学与医药化工学院柯世省（一）核酸密度的测定8MCsCl，45000rpm，16h密度梯度：1.80g/ml（底部）～1.55g/ml（顶部）平衡时：浮力密度=CsCl密度=离心力ρ=ρ0+4.2ω2（r2-r02）×10-10ρ：浮力密度ω：角速度（弧度/秒）r：样品到

8、转轴的距离楚雄师范学院化学与生命科学系范树国6/16/2021台州学院生命科学与医药化工学院柯世省6/16/2021台州学院生命科学与医药化工学院柯世省（二）测定DNA的G-C含量G-C含量与DNA的浮力密度之间呈正比关系ρ=0.100xG-C+1.658xG-C=（ρ-1.658）×10但含5-甲基胞嘧啶多的DNA，其实际浮力密度会降低，低于理论值。楚雄师范学院化学与生命科学系范树国6/16/2021台州学院生命科学与医药化