第15章 核酸的研究方法

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1、第十五章核酸的研究方法第一节核酸的分离、提纯和定量测定一、DNA的分离用1mol/L的NaCl制备组织匀浆，离心除去组织残渣，多次用苯酚处理使蛋白质变性，每次处理后离心取上层水相，最后加2倍体积的乙醇沉淀出DNA。二、RNA的分离由于RNA酶存在广泛，且十分稳定，破碎细胞时要加入胍盐破坏RNA酶，试剂要用0.1%的DEPC（焦碳酸二乙酯）配制，器皿要高压灭菌或用0.1%的DEPC处理，多次用苯酚或氯仿处理使蛋白质变性，每次处理后离心取上层水相，mRNA可用寡聚dT-纤维素亲和层析从总RNA中分离。三、核酸含量的测定法常用的方法是测定260

2、nm的消光度，用公式计算核酸的含量。核酸的含量也可以用定磷法测定。DNA的含量可以用二苯胺显色法测定。RNA的含量可以用地衣酚显色法测定。第二节核酸的超速离心及核酸的凝胶电泳一、核酸的超速离心超速离心可以分离超螺旋DNA（密度大），线性DNA（密度小）和闭环DNA（密度居中）。也可以分离RNA。二、核酸的凝胶电泳从细菌抽提得到的质粒DNA样品中不含线状DNA第三节核酸的核苷酸序列测定一、DNA的酶法（末端终止法）测序二、DNA的化学法测序DNA酶法测序自动化：使用4种荧光素标记的双脱氧核苷酸，毛细管电泳和激光扫描技术使测序自动化，一个泳道

3、一次可测大约1000个核苷酸，测序已成为可以快速完成的常规技术。人类基因组测序已经完成，多态性的研究和功能基因组学已经成为研究的热点。限制性酶切位点分析是绘制物理图的常用方法。由于测序仪在一个泳道只能准确测出几百个核苷酸，对于长DNA，只能将其切成小段再测序，为了组装，需要确定足够多的标记位点。常用遗传图、转录图、物理图、序列标签位点(STS)、表达序列标签(EST)等方法确定标记位点。三、RNA的测序RNA的测序可以用4种特异性的酶切割（从胰脏提取的RNaseA水解嘧啶核苷酸的磷酸二酯键，米曲霉中提取的RNaseT1水解鸟苷酸的磷酸二酯

4、键，黑粉曲霉中提取的RNaseU2水解腺苷酸的磷酸二酯键，多头黏菌中提取的RNasePhyI水解A、U、G三种核苷酸的磷酸二酯键），凝胶电泳分离，用类似蛋白质序列分析的方法推断核苷酸序列。也可以用化学试剂断裂RNA链，用类似DNA化学测序的方法推断核苷酸序列。最常用的方法是逆转录成cDNA，用DNA测序的方法推断核苷酸序列。第四节聚合酶链反应（PCR）一、PCR的定义PCR(polymerasechainreaction)是应用最广的分子生物学技术之一，模板DNA的含量以指数方式增加，可用来快速在体外扩增DNA，PCR技术在临床检验和分子

5、生物学中的应用十分广泛。耐热DNA聚合酶的发现推动了这一技术的广泛应用。（二）复合PCR(multiplexPCR)?在同一反应中用多组引物同时扩增几种基因片段的方法称复合PCR。复合PCR主要用于同一病原体分型及同时检测多种病原体。此外也常用于多点突变性分子病的诊断。?（三）不对称PCR(asymmetricPCR)?两种引物比例相差较大的PCR称不对称PCR。不对称PCR可制备用于核酸序列分析的单链DNA片段或核酸杂交的探针等。（四）反转录PCR(reversetranscriptionPCR)?由于Taq酶只能以DNA为模板，当待扩

6、增模板为RNA时，需先将其反转录为cDNA才能进行PCR扩增，这种PCR技术称为反转录PCR，在分子生物学和临床检验等领域均有广泛应用。?（五）涂片PCR(slide-PCR)?直接对载玻片上细胞涂片或组织切片进行PCR扩增的方法称涂片PCR。涂片PCR结合原位杂交技术特别适用于病理切片中含量较少的靶序列的PCR检测。（六）反向PCR(inversePCR)?扩增引物相反方向DNA序列的PCR技术称反向PCR。在反向PCR中，要先将含有一段已知序列的感兴趣的未知DNA片段进行酶切和环化，然后直接进行PCR，也可将已知序列酶切后再进行PCR

7、。反向PCR主要用于已知序列两翼未知DNA序列的扩增。（七）锚定PCR(anchoredPCR)?用酶法在一通用引物反转录的cDNA3′端加上一段已知序列，然后以此序列为引物结合位点对该cDNA进行PCR扩增称为锚定PCR，可用于未知cDNA的制备及低丰度cDNA文库的构建。（八）修饰引物PCR?为达到某些特殊应用目的如定向克隆、定点突变、体外转录及序列分析等，可在引物的5′-末端加上酶切位点、突变序列、转录启动子及序列分析物结合位点等，这种PCR技术称为修饰引物PCR。此外，还可将一些信号分子如荧光素、生物素等连接于引物的5′末端，当P

8、CR完成后可对产物直接进行检测。?PCR在生命科学中的应用非常广泛，已有不少专著可供读者参考。第五节DNA的化学合成固相磷酰亚胺法合成时，末端核苷酸的3′-OH与固相载体成共价键，5′-OH被