基因克隆、假病毒操作步骤.doc

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1、实验名称：基因克隆实验器材:荧光定量PCR仪、摇床、离心机、生工PCR产物纯化试剂盒、恒温加热器、NEB连接体系、灭菌纯水、JM109感受态、冰、LB培养基、酒精灯、涂棒、氨苄、氨苄抗性平板、甘油等；操作步骤：1、可通过PCR进行拼接获得目的基因的，过柱纯化（生工试剂盒根据说明书进行纯化，在最后一步的洗脱可以用预热的灭菌纯水洗脱，在加灭菌纯水洗脱的时候一定要加在纯化柱子的膜中间）；2、选择合适的载体（EZ-T）用连接酶进行连接，NEB体系，16℃过夜连接T4lages1.010×T4buffer2.0EZ-T1.0目的基因8.0DdH2O8.0＿＿＿＿＿＿＿＿＿20ul3、取100µl摇

2、匀后的JM109感受态细胞悬浮液（如是冷冻保存液，则需化冻后马上进行下面的操作），加入10µl连接产物，轻轻摇匀，冰上放置30min后，于42度水浴中保温90s，然后迅速在冰上冷却2min；4、加入500µlLB液体培养基，混匀于37℃振荡培养45min使受体菌恢复正常生长状态并使转化体产生抗药性；5、将恢复培养的菌体5000rpm离心3min，移去上层LB培养基，用余下的200µl重悬菌体，并用灭菌玻璃推子(酒精灯上烧后冷却)，均匀涂布于琼脂凝胶表面（氨苄抗性），37℃倒置培养12~16小时；6、挑取多个单克隆菌落分别接种到1ml含有抗生素（氨苄）的LB液体培养基中，37℃振荡培养3h

3、；7、培养1-2小时即可以利用PCR（定量或定性）进行鉴定；8、选取初步鉴定阳性的菌液送测序，测序正确后甘油保存（甘油的浓度为30%-50%），充分混匀，-80℃保存；实验名称：假病毒的制备实验器材：荧光定量PCR仪、摇床、离心机、生工小剂量抽提试剂盒、生工胶回收试剂盒、恒温加热器、NEB连接体系、灭菌纯水、冰、LB培养基、氨苄、卡那、卡那抗性平板、甘油等；操作步骤：1、选取测序结果正确的菌种以1：100的比例接种到含氨苄（1：1000）的5mlLB培养基中过夜培养中，37℃，200r/min；2、收集菌体抽提质粒，用生工小剂量抽提质粒试剂盒跟据说明书进行抽提，在抽提过程中要注意防污染（

4、在最后一步的洗脱可以用预热的洗脱液洗脱，在加洗脱液的时候一定要加在纯化柱子的膜中间）；3、用抽提好的质粒做双酶切用NEB公司的体系，同时做一管PET28-MS2的双酶切20ulBamH12.5ulBamH11.0ulHindIII2.5ulHindIII1.0ulBSA5.0ulBSA2.0ulBuffer25.0ulBuffer22.0ul产物20ulPET28-MS28.0H2O15ulH2O15ul＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿50.0ul20.0ul37度3小时，4、配置1%的大空胶，将双酶切产物跑胶，割胶（在割胶的时候要注意产物不要在紫外灯光下暴露太久），

5、用生工胶回收试剂盒进行回收根据说明书进行纯化；PET28-MS2直接用生工PCR产物回收试剂盒进行纯化；5、将回收好的酶切产物进行连接用NEB的连接体系，16℃，过夜连接T4lages1.0ul10×T4buffer2.0ulPET28-MS24.0ul目的片段8.0ulDdH2O6.0ul＿＿＿＿＿＿＿＿＿20ul6、取100µl摇匀后的BL21感受态细胞悬浮液（如是冷冻保存液，则需化冻后马上进行下面的操作），加入10µl连接产物，轻轻摇匀，冰上放置30min后，于42度水浴中保温90s，然后迅速在冰上冷却2min；7、加入500µlLB液体培养基，混匀于37℃振荡培养45min使受体

6、菌恢复正常生长状态并使转化体产生抗药性；1、将恢复培养的菌体5000rpm离心3min，移去上层LB培养基，用余下的200µl重悬菌体，并用灭菌玻璃推子(酒精灯上烧后冷却)，均匀涂布于琼脂凝胶表面（卡那抗性），37℃倒置培养12~16小时；2、挑取多个单克隆菌落分别接种到1ml含有抗生素（卡那）的LB液体培养基中，37℃振荡培养，培养1-2小时即可以利用PCR（定量或定性）进行鉴定；3、选取初步鉴定阳性的菌液送测序，测序正确后甘油保存（甘油的浓度为30%-50%），充分混匀，-80℃保存；4、选取测序结果正确的菌种以1：100的比例接种到含卡那霉素的5mlLB培养基中过夜培养，37℃，2

7、00r/min；5、将1ml过夜培养的菌液接种到100ml含卡那青霉素的LB培养基中，37℃，200r/min振荡培养4-6h至OD600值大约在0.6-0.8；6、加入终浓度为1mmol/L(IPTG)，在37℃条件下，200r/min诱导表达16h；7、10,000rpm，4℃，离心10min，收集菌体，加入1×超声buffer5ml重悬菌体；<摇床一小时>8、超声处理：置于冰上超声，功率300W，超声时间2<5>s，间隔时间3